一、乳腺癌中P21基因产物的表达及其临床意义（论文文献综述）
王阳[1]（2019）在《长链非编码RNA lnc-Z38对胃癌发生发展的调控作用和相关机制研究》文中研究表明胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康,其发病率居世界第五位,死亡率居世界第三位。世界上每年约有一百万例新发胃癌患者,发展中国家发病患者约占2/3,约有42%的胃癌患者发生在中国。早期诊断和治疗对胃癌患者的病情以及预后具有重要意义,这也成为目前胃癌研究的热点问题。从胃癌的整个发展演变过程来看,涉及到多基因的异常调节和多步骤的参与,最终引起细胞生物学行为出现异常。越来越多的研究发现,基因对胃癌的发生发展具有很大影响。在胃癌患者的人体中某些基因与正常人体之间的遗传相关性发生了改变,这些变异基因可能是引起胃癌发生的关键。如果异常细胞行为所产生的改变是基于基因层面,那么将会引起细胞的结构和功能产生不可逆的改变,由此引发相关细胞发生癌变。此外,肿瘤的复发和远处转移是导致胃癌患者死亡的最主要原因,对胃癌患者的治疗和预后具有重要影响。因此,对胃癌的发病和转移机制进行深入研究,可为胃癌的早期诊断和预后评估提供理论依据,同时也为探索胃癌新的诊断方法以及发现新的治疗靶点提供理论基础。以前对于胃癌的研究主要集中在蛋白质编码基因上,主要涉及表观遗传学、遗传学和相关信号通路的调控。随着高通量测序技术的发展,研究人员发现,人类基因组中非编码RNA（Non-coding RNA,ncRNA）的比例占95%以上,蛋白质编码RNA与功能性非编码RNA之间的复杂相互作用对胃癌的发生和发展中起着重要作用。长链非编码（long non-coding RNA,lncRNA）作为ncRNA的重要组分之一,正受到越来越多的关注。长链非编码RNA一般位于细胞核内或细胞浆内,转录本长度一般都大于200个核苷酸,很少参与蛋白的编码,主要以RNA的形式在表观遗传、转录、转录后水平调控基因的表达。LncRNA参与基因组印记、染色质修饰、染色体沉默、mRNA转录激活及干扰、转录后的调控、调节原癌基因活化、核内运输等重要的调控过程。它不仅可以激活某些蛋白质编码基因的表达,还可以抑制蛋白质编码基因的表达。近年来,长非编码RNA在肿瘤机制的研究中受到越来越多的关注。到目前为止,已有许多lncRNA与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移以及复发等密切相关。在先前的胃癌研究中,有研究报道在胃癌组织和邻近的正常非肿瘤组织中具有明显差异表达的lncRNA。一些lncRNA如HULC、H19可通过调节下游靶基因影响胃癌细胞的增殖和侵袭能力,从而导致胃癌的发生和发展。目前关于lncRNA在胃癌中的研究尚处于起步阶段,探索和发现新的lncRNA及其特异性调控机制,可为研究胃癌的发病机制提供新的理论依据。本研究中我们利用生物信息学分析、高通量测序结合经典分子生物学技术等,在分子水平、细胞水平、以及临床样本中探索长链非编码RNA lnc-Z38对胃癌生物学效应的影响及相关机制。第一部分 lncRNAZ38在胃癌组织和细胞株中的表达及其临床意义研究背景胃癌是目前世界上最常见恶性肿瘤之一。在中国,男性胃癌的发病率居所有恶性肿瘤发病率的第二位,女性发病率居第五位,严重危害我国国民健康。胃癌的发生和发展需要经历一个多阶段、多种因素参与的过程。最近的研究表明,长链非编码RNA与肿瘤的发生和发展密切相关,它可以在转录、转录后和翻译水平上调节肿瘤相关基因的表达。目前,已发现胃癌组织中存在多种异常表达的lncRNA,并且这些异常表达的lncRNA对胃癌的发生和发展发挥重要的调控作用。然而,关于lncRNA在胃癌中的具体作用机制尚未完全阐明,还有待于进一步探讨。方法及结果我们对5对胃癌病人的癌组织及癌旁组织进行了 lncRNA表达谱高通量测序的检测。通过生物信息学分析发现lncRNAZ38在胃癌组织中显着高表达;采用qPCR技术在100例胃癌及癌旁组织中验证,证实了 lncRNAZ38在胃癌组织中高表达;分析lncRNAZ38表达水平与1 00例胃癌患者临床病理参数的关联性,我们发现lncRNAZ38的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、远处转移显着相关,与性别、年龄无关。同时,我们对正常胃黏膜上皮细胞株（GES-1）和胃癌细胞株（KATO Ⅲ、SGC 7901、AGS、MKN45、MKN74）进行qPCR检测lncRNAZ38的表达,发现与正常胃黏膜上皮细胞相比,胃癌细胞系的五种癌细胞lnRNAZ38均呈现高表达。小结本研究发现与癌旁组织相比,lncRNAZ38在胃癌组织中表达水平显着升高（p<0.05）,且表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、远处转移具有显着相关性。与正常胃黏膜上皮细胞相比,胃癌细胞中lnRNAZ38呈现高表达。这为lncRNAZ38作为评价胃癌发展进程、预后评估以及作为潜在肿瘤标志物提供重要参考,也为进一步深入研究lncRNAZ38在胃癌中的作用及其调控机制提供依据。第二部分 lncRNAZ38对胃癌细胞生物学效应的影响研究背景肿瘤的发生和发展受多种因素的影响,与基因密切相关。肿瘤的转移是导致恶性肿瘤患者死亡的最主要的原因,占肿瘤相关死亡率的90%以上。远处组织或器官转移是癌症患者预后不良的一个重要标志。肿瘤的发生、发展以及转移是非常复杂的过程,包含肿瘤细胞的生长,转化,侵袭,扩散、血管生成以及随后的粘附和定植,涉及许多不同的基因和途径。长链非编码RNA长期以来被认为是没有蛋白质编码能力的非功能性序列。近年来,越来越多的研究发现lncRNA可以在转录,转录后和翻译水平上调节基因表达以发挥生物学功能,影响肿瘤细胞的定植、侵袭、凋亡和转移等生物学效应。前面的实验我们发现lncRNAZ38在胃癌组织中显着高表达且表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、远处转移具有显着相关性,同时前期研究发现lncRNAZ38在乳腺癌中表达增高,是乳腺癌不良预后的指标,那么接下来我们研究lncRNAZ38对胃癌细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学效应的影响。方法及结果1、成功构建干扰lncRNAZ38的胃癌细胞株AGS细胞和MKN74细胞。2、CCK-8及平板克隆形成实验发现干扰lncRNAZ38表达的胃癌细胞株AGS和MKN74细胞的增殖能力及克隆形成能力显着减弱。3、Trans-well实验及划痕实验发现干扰lncRNAZ38表达的胃癌细胞株AGS和MKN74细胞的迁移和侵袭能力显着减弱。4、流式细胞凋亡检测及相关的半胱天冬酶相对活性测定发现干扰lncRNAZ38表达后通过增加caspase-3和caspase-9的活性来促进细胞凋亡。小结本研究初步证明lncRNAZ38能够促进胃癌细胞增殖、侵袭及转移并抑制胃癌细胞的调亡。第三部分 lncRNAZ38参与胃癌发生发展的分子机制初步探讨研究背景既往关于胃癌发生、发展的分子机制研究主要集中在传统的蛋白质编码基因上,主要涉及表观遗传学、遗传学和相关信号通路的调控等方面。近年来,随着高通量测序技术的发展,非编码RNA,特别是长链非编码RNA,在肿瘤机制研究中受到越来越多的关注。到目前为止,据报道许多lncRNA与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及复发密切相关。同样,在胃癌的研究中,已发现胃癌组织与癌旁正常组织中有多种明显差异表达的lncRNA,并且一些lncRNA如H19等可通过不同的机制调控下游靶基因对胃癌细胞的增殖或侵袭能力产生影响,进而促进胃癌的发生和发展。目前,关于lncRNA在胃癌中的研究尚处于起步阶段,因此探索和发现新的lncRNA,研究其分子调控机制,可为研究胃癌的发病机理提供新的研究方向和理论基础。前面的实验我们发现lncRNAZ38可促进胃癌的浸润、转移,抑制胃癌细胞的凋亡,接下来我们研究lncRNAZ38对胃癌发生、发展进行调控的分子机制。方法及结果1、成功构建稳定过表达lncRNAZ38的胃癌细胞株AGS细胞和MKN74细胞。2、将稳定过表达lncRNAZ38的胃癌细胞株AGS和其平行对照细胞进行高通量测序。根据检测结果结合生物信息学分析我们初步预测lncRNAZ38可通过TGF-beta信号通路对胃癌进行调控作用。3、我们选取TGF-beta信号通路中上调基因ID3、BMP6,下调基因GDF-5进行验证。通过Western Blot检测,结果与高通量测序结果相一致,说明lncRNAZ38可通过TGF-beta信号通路对胃癌进行调控作用。小结本研究发现lncRNAZ38可通过TGF-beta信号通路对胃癌发挥调控作用,从而影响胃癌的发生、发展进程。
姜丹丹[2]（2019）在《MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响》文中研究说明研究背景:乳腺癌对于我国女性来说是很大的威胁,每年新生和死亡人数分别占世界的12.2%和9.6%。随着医学科学的发展,乳腺癌的诊治已经有了比较大的进步,获得了很高的治愈率和生存率。但是乳腺癌患者仍然有高复发率和转移率。乳腺癌的内科治疗包括化疗、内分泌治疗和靶向治疗。近几年来,乳腺癌靶向治疗已成为临床研究的热点话题,其临床应用明显提高了乳腺癌的诊疗效果。已经针对不同的乳腺癌亚型开发了越来越多的靶向疗法。这些药物的临床应用改善了乳腺癌的治疗效果,并不断改变乳腺癌的临床实践过程。如何克服癌症的耐药性,开发出能够超越传统靶向药物疗效的新药,是未来的重要研究方向。MYC是一个强大的原癌基因,原发于Burkitt淋巴瘤t（8;14）（q24;q32）染色体中发现。MYC是螺旋亮氨酸拉链家族成员,和它的其他家族成员N-MYC、L-MY C一样,都是转录因子。MYC是以核定位序列,螺旋-环-螺旋二聚区域,DNA结合区域和转录调节区域为基础发挥其功能作用。正常细胞中,MYC原癌基因在转录水平、转录后水平、细胞周期检验点和染色体有丝分裂中严格受多种调控机制和信号转导通路等调控。这些严格调控机制使细胞不能发生癌变,而目前为止MYC是最频繁失调控的致癌基因之一。在50%的人类癌症中,MYC家族致癌基因存在调节失控,这往往与患者不良预后和生存不利有关。MYC几乎在致癌过程的每个方面都发挥着重要作用,协调增殖、凋亡、分化和代谢。尽管抑制MYC是治疗多种癌症的有效方法,但由于其蛋白结构不可药物化,直接靶向MYC已经是一个挑战。因此,为了达到理想的抗肿瘤效果,人们广泛探索MYC阻断的替代方案,包括MYC/Max复合物阻断、MYC转录和/或翻译抑制、MYC失稳以及与MYC过表达相关的合成致病性。MYC调控异常引起的细胞凋亡是一种重要的调节机制,在预防致瘤细胞增殖中起着非常重要的作用。致癌基因MYC诱导的细胞凋亡是通过p53依赖和非p53依赖途径发生的,其机制尚不清楚。p53基因在约50%的人类恶性肿瘤中存在突变,p53抑制肿瘤活性的丧失与细胞周期阻滞和细胞凋亡密切有关。有报道提出,p53缺失引起的DN A修复过程的缺失与在p53缺失小鼠中观察到的高癌症易感性相关。MYC在乳腺癌组织中的扩增率大约30%。大量基础研究数据表明,原癌基因MYC的扩增在乳腺癌发病机制中具有重要作用,但其扩增频率和在人类研究中的预后相关性并不一致。有研究显示,MYC扩增与已知预后因素的关系（肿瘤分级、淋巴结转移、激素受体阴性）有显着的相关性;扩增与复发和死亡风险显着相关。由此可见,MYC失调可导致乳腺癌的发生和进展,并与不良预后相关。因此,靶向MYC调控通路可为乳腺癌治疗提供一种有前途的策略。我们研究的目的就是希望了解MYC与乳腺癌临床病理特征,预后的相关性并初步探讨其在p53缺失的乳腺癌细胞中的作用机制。研究目的:1、检测乳腺癌组织中MYC的表达,分析其与临床病理因素,复发转移的关系,探讨MYC与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移的关系;2、观察野生型MYC和突变型MYC（T58A）对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其原因;3、借助体外RNAi沉默基因技术探讨MYC基因通过调节上游基因p14,p21从而调控非p53依赖性凋亡的重要因子Bim的机制。材料和方法:1、检测MYC过表达和乳腺癌临床病理特征及复发转移的关系（1）选取并收集2013年6月至2014年1月青岛大学附属医院收治的100位浸润性乳腺癌患者癌组织及癌旁组织样本。（2）免疫组化检测分析组织标本中MYC的表达。（3）收集整理临床病理数据资料,将MYC的表达情况与临床病理因素进行相关性分析;分析MYC与乳腺癌5年DFS的关系。2、观察MYC野生型及突变型（T58A）对p53缺失乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响（1）分别应用携带MYC野生型及突变型（T58A）慢病毒载体介导转染p53缺失的HCC1937乳腺癌细胞。（2）采用菌落形成法和MTT法检测MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞增殖的影响。（3）流式细胞仪测凋亡法和TUNEL法检测MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞凋亡的影响。3、分析MYC在p53缺失情况下对Bim的调控作用（1）通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法检测MYC、Bim mRNA和蛋白水平的表达,分析MYC野生型及突变型（T58A）对乳腺癌细胞增殖和凋亡调控的作用机制。（2）RT-PCR和Western blot检测MYC和Bim信号通路中p14、p21的mRNA和蛋白的表达水平。（3）借助体外RNAi沉默基因技术干扰p21的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p21的表达水平。（4）采用菌落形成法和MTT法检测干扰p21后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。（5）借助体外RNAi沉默基因技术干扰p14的表达。通过RT-PCR和Western blot检测干扰后Bim、p14的表达水平。（6）采用菌落形成法和MTT法检测干扰p14后对细胞增殖的影响,流式细胞术和TUNEL法检测对细胞凋亡的影响。结果:1、免疫组化结果显示MYC在乳腺癌组织中的阳性率为36%（36/100）;在癌旁正常组织中,阳性率为12%（12/100）;MYC在癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织,二者比较有统计学意义（p<0.05）。2、MYC阳性表达与乳腺癌的年龄不相关,在小于等于50岁的患者中,阳性率为37.2%（16/43）,在大于50岁的患者中,阳性率为35.1%（20/57）,二者差别无统计学意义（p=0.827）。3、MYC阳性表达与乳腺癌的肿瘤直径相关,在小于等于2cm的患者中,阳性率为25%（12/48）,而在大于2cm的患者中,阳性率为46%（24/52）,MYC在肿瘤直接大于2cm的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.028）。4、MYC阳性表达与乳腺癌的TNM分期相关,在分期为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为26.8%（15/56）,而分期为Ⅲ的患者中,阳性率为47.7%（21/44）;MYC在分期越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.030）。5、MYC阳性表达与乳腺癌的细胞学分级相关,在分级为Ⅰ+Ⅱ的患者中,阳性率为27.6%（16/58）,而分级为Ⅲ的患者中,阳性率为47.6%（20/42）,MYC在分级越高的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.039）。6、MYC阳性表达与乳腺癌的ER状态相关,在ER阳性的患者中,阳性率为25%（15/60）,而ER阴性的患者中,阳性率为52.5%（21/40）,MYC在ER阴性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.005）。7、MYC阳性表达与乳腺癌的HER状态相关,在HER2阳性的患者中,阳性率为48.6%（18/37）,而HER2阴性的患者中,阳性率为28.6%（18/63）,MYC在HER2阳性的患者中阳性率越高,二者差别有统计学意义（p=0.043）。8、MYC阳性表达与乳腺癌的淋巴结状态无关,在淋巴结阳性的患者中,阳性率为43.1%（25/58）,而淋巴结阴性的患者中,阳性率为26.1%（11/42）,二者差别无统计学意义（p=0.082）。9、MYC阳性表达与乳腺癌的术后复发转移相关,在5年内复发的患者中,阳性率为60%（12/20）,而5年内未复发的患者中,阳性率为29.2%（24/80）;MYC阳性患者具有更高的复发风险,二者差别有统计学意义（p=0.012）。10、MYC阳性表达与乳腺癌的p53表达无关,在p53表达阳性的患者中,阳性率为39.6%（21/53）,而p53表达阴性的患者中,阳性率为31.9%（15/47）,二者差别无统计学意义（p=0.642）。11、MYC野生型及突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞。两者较对照组均能诱导细胞增殖（p<0.01）;野生型同时能够诱导细胞凋亡（p<0.01）,而突变型不能诱导凋亡（p>0.05）。12、RT-PCR和Western blot结果显示,MYC野生型转染组细胞Bim表达水平升高（p<0.01）。MYC突变型（T58A）转染组细胞Bim与对照组表达无明显差异（p>0.05）。13、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21表达水平下降（p<0.01）,Bim表达水平升高（p<0.01）;RNAi沉默p21后,Bim表达水平较沉默前更高（p<0.01）。MYC突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p21及Bim表达水平均没有发生变化（p>0.05）,同时转染T58A并RNAi沉默p21后,Bim表达水平与单纯沉默p21无明显差异（p>0.05）。14、MYC野生型成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14表达水平升高（p<0.01）,同时Bim表达水平升高（p<0.01）;RNAi沉默p14后,Bim表达水平较沉默前降低（p<0.01）。MYC突变型（T58A）成功转染p53缺失的HCC1937细胞后,p14及Bim表达水平均没有发生变化（p>0.05）,同时转染T58A并RNAi沉默p14后,Bim表达水平与单纯什么p14无明显差异（p>0.05）。结论:1、MYC在乳腺癌组织中的高表达与肿瘤直径、细胞学分级、病理分期、激素受体状态、HER2状态有关;且MYC阳性患者5年内复发转移风险增高,表明MYC阳性表达与乳腺癌预后相关。2、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC可以促进细胞增殖和凋亡,而MYC发生突变后,仅能促进细胞增殖,却不能促进凋亡。3、在p53缺失的乳腺癌细胞中,MYC通过MYC/p21/Bim及MYC/p14/Bim这两种信号通路在细胞增殖和凋亡中发挥调控作用;MYC突变后,不能调控p21、p14,进一步不能调控Bim参与细胞凋亡的调控。
李晓菊[3]（2019）在《FOXP3与Galectin-1的相互作用拮抗FOXP3抑癌功能及机制研究》文中研究说明【研究背景】叉头状转录因子3（FOXP3）属于FOX蛋白家族成员,具有标志性的叉头状DNA结合结构域。作为调节性T细胞（Treg）的标志性分子,FOXP3在Treg的分化和发育过程中发挥着重要的作用。近年来大量研究发现,FOXP3也表达于正常乳腺上皮细胞中,并且其表达缺失或突变是导致乳腺癌发生发展的重要因素。作为一个重要的抑癌基因,FOXP3主要通过调控乳腺癌发生发展相关基因的表达来发挥其抑癌功能。然而我们的前期研究结果显示,部分乳腺癌细胞中依然存在野生型FOXP3的表达,这提示在这些乳腺癌细胞中FOXP3的功能可能受到了抑制,无法发挥抑癌作用,最终导致肿瘤的发生发展。可目前仍不清楚导致FOXP3抑癌功能丧失的机制。【研究目的】本研究拟通过对乳腺癌临床样本分析、体外细胞学实验以及生物信息学分析,系统阐明导致乳腺癌中FOXP3抑癌功能丧失的原因及其分子机制,完善FOXP3在乳腺癌发生发展中的作用,为乳腺癌的FOXP3基因治疗提供理论基础。【研究方法】1.收集乳腺癌临床标本,检测FOXP3在乳腺癌细胞中的表达及定位情况;2.通过免疫共沉淀实验（Co-IP）、荧光共振能量转移实验（FRET）等系统验证FOXP3能与Gal-1相互作用;3.通过生物信息学分析模拟FOXP3与Gal-1的相互作用,预测FOXP3与Gal-1的相互作用位点,随后构建相应的截短体和突变体,通过Co-IP实验确定FOXP3与Gal-1的相互作用位点;4.构建FOXP3过表达的MDA-MB-231细胞,并向细胞内转染Gal-1,运用ChIPSeq实验,从全基因组的角度检测FOXP3对靶基因的调控是否受FOXP3-Gal-1相互作用的影响,并运用real time PCR和ELISA在转录和翻译水平对测序结果进行验证;5.构建过表达Gal-1或Gal-1突变体的乳腺癌细胞株,利用xCELLigence RTCA以及Transwell实验,分析FOXP3与Gal-1的相互作用对FOXP3抑癌功能的影响;6.选取FOXP3阳性的乳腺癌组织以及配对的癌旁组织,通过免疫组化实验观察Gal-1在乳腺癌细胞中的表达情况;7.对乳腺癌细胞进行3D培养,通过免疫荧光实验检测乳糖及乳腺癌细胞酸性培养基对Gal-1亚细胞定位的影响;8.对乳腺癌细胞酸性培养基中唾液酸的含量进行检测,探讨Gal-1在乳腺癌细胞核内高表达的原因。【研究结果】1.临床样本分析显示FOXP3在32.1%（53/165）的乳腺癌标本中呈细胞核表达;2.FOXP3与Gal-1在乳腺癌细胞中能够发生相互作用,且它们的相互作用主要位于细胞核内;3.FOXP3通过其FKH结构域与Gal-1的N-端3-10氨基酸区域结合;4.ChIP-Seq结果显示,FOXP3主要结合于靶基因的启动子区域,且其靶基因多为一些参与肿瘤相关通路的基因;而当过表达Gal-1后,FOXP3能够结合到的靶基因数量显着减少;5.FOXP3与Gal-1的相互作用减弱了FOXP3对乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的抑制作用;6.在乳腺癌组织中,Gal-1主要表达于乳腺癌细胞的胞核内,而在癌旁组织中,Gal-1主要表达于乳腺癌细胞的胞质或组织间隙;7.乳腺癌细胞3D培养结合免疫荧光实验显示乳糖可以诱导乳腺癌细胞中Gal-1的亚细胞定位由细胞核向细胞质的改变,而乳腺癌细胞酸性培养基的加入则阻断了上述过程使得Gal-1在细胞核内大量聚集;8.乳腺癌细胞酸性培养基中唾液酸的含量显着增高。【结论】1.本研究系统证实FOXP3能够与Gal-1相互作用,且分别是FOXP3的FKH结构域和Gal-1的N端3-10氨基酸区域介导了它们的相互作用;2.FOXP3主要通过其FKH结构域发挥抑癌作用,而Gal-1会与FOXP3的FKH结构域结合,导致FOXP3丧失对相关靶基因的调控作用;3.FOXP3与Gal-1的相互作用能够抑制FOXP3对乳腺癌细胞生长、转移的抑制作用;4.乳腺癌组织中的酸性微环境导致Gal-1在细胞核内的聚集,而细胞核内过多的Gal-1会与FOXP3相互作用,进而抑制FOXP3的抑癌功能。
顾页[4]（2019）在《SET7/9介导E2F1甲基化途径调控肝细胞癌恶性表型及相关机制的研究》文中提出研究背景与目的:肝细胞癌（HCC）是目前最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡的主要原因之一。肝细胞癌术后复发率高,转移迅速。此外,不适合手术的中晚期患者,化疗和放疗效果也欠佳。肝细胞癌的发病机制极其复杂,涉及遗传异常或表观遗传异常等多种因素。深入探讨肝细胞癌发生的分子基础有助于揭示肝细胞癌的致病机理,提供更好的治疗靶点与治疗方案,提高患者生存率。SET7/9是蛋白赖氨酸甲基转移酶（protein lysine methyltransferase）家族的成员,其编码基因位于人染色体4q28上,转录产生的mRNA全长7374 nt,CDS编码区长度为1098 nt,编码蛋白由366个氨基酸组成。SET7/9可催化组蛋白H3第四位赖氨酸（H3K4）和一些非组蛋白赖氨酸甲基化。这些非组蛋白包括转录因子、肿瘤抑制因子和表观遗传调控因子等。近年研究发现,蛋白赖氨酸甲基化是细胞内一种关键性翻译后修饰手段,可影响细胞生长、增殖和凋亡等生物学过程。人类不同肿瘤组织中常检测到SET7/9异常表达;SET7/9可负向或正向地调节其蛋白底物活性,引起与肿瘤发生、发展相关的多种细胞效应。本文主要观察肝细胞癌中SET7/9的表达情况,探讨SET7/9介导的非组蛋白甲基化调控肝细胞癌恶性表型的作用及机制。转录因子E2F1是E2F（E2 promoter-binding factor）家族成员,其编码基因位于人染色体20q11上,转录产生的mRNA全长2486 bp,编码蛋白由437个氨基酸组成。E2F1可调控多种基因表达,影响DNA合成、细胞周期和凋亡。E2F1过量表达既可驱使细胞进入S期,也可诱导细胞凋亡,其对细胞周期和凋亡的调控取决于其修饰类型和稳定性。E2F1肽链第185位赖氨酸甲基化修饰可抑制该蛋白乙酰化和磷酸化,促进其泛素化降解而抑制凋亡。E2F1起促凋亡作用时,经p53依赖性与p53非依赖性两种细胞信号通路活化下游Caspase-3、Caspase-9等促凋亡蛋白。因此,对于E2F1这种受SET7/9靶甲基化作用的非组蛋白,明确肝细胞癌细胞中SET7/9调节E2F1甲基化修饰变化的效应及机制是本文的重点内容。方法:本课题主要从临床病理分析、细胞功能实验与相关分子机制三方面对SET7/9介导的E2F1甲基化修饰对肝细胞癌恶性表型的调控作用及机制开展研究。1.人肝细胞癌组织中SET7/9表达状况与临床特征相关性分析采用免疫组化法检测入组的68例肝细胞癌组织与癌旁组织中SET7/9表达状况;统计分析SET7/9蛋白表达水平与病人年龄、性别、TNM分期、病理学分期等临床特征的关系。2.人肝细胞癌组织中E2F1表达状况与临床特征相关性分析采用免疫组化法检测入组的68例肝细胞癌组织与癌旁组织中E2F1表达状况,以及肝细胞癌组织标本中SET7/9与E2F1两者表达的相关性;统计分析E2F1蛋白表达水平与病人年龄、性别、TNM分期、病理学分期等临床特征的关系。3.SET7/9和E2F1在人肝细胞癌细胞中表达变化的细胞功能效应及其与甲基化修饰的相关性采用Western Blot法检测HepG2、Huh7、SMMC-7721和Bel-7404四种肝细胞癌细胞株和LO2正常肝细胞株中SET7/9与E2F1表达水平。选取合适的细胞株,采用SET7/9表达质粒或干扰表达质粒分别转染SET7/9低表达、高表达细胞株,构建SET7/9过表达细胞模型和干扰表达细胞模型。同时分别以转染空载质粒或scramble-shRNA质粒细胞株作为对照。通过Western Blot法检测转染前后SET7/9表达变化,确定转染效率。再采用CCK8法检测SET7/9过表达或干扰表达后细胞增殖能力;采用小室侵袭实验检测SET7/9过表达或干扰表达后细胞侵袭能力;采用划痕愈合实验检测SET7/9过表达或干扰表达后细胞迁移能力。选取合适细胞株,采用E2F1表达质粒或干扰表达质粒分别转染E2F1低表达、高表达细胞株,构建E2F1过表达细胞模型和干扰表达细胞模型。同时分别以转染空载质粒或scramble-shRNA质粒细胞株作为对照。通过Western Blot法检测质粒转染前后E2F1表达变化,确定转染效率。再采用CCK8法检测E2F1过表达或干扰表达后细胞增殖能力;采用小室侵袭实验检测E2F1过表达或干扰表达后细胞侵袭能力;采用划痕愈合实验检测E2F1过表达和干扰表达后细胞迁移能力。上述SET7/9与E2F1两者干扰表达实验结果均与蛋白甲基化抑制剂MTA（5’-deoxy-5’-methylthioadenosine）处理细胞结果进行比较,以反映前两者效应与蛋白分子甲基化修饰的关系。4.人肝细胞癌中SET7/9介导的甲基化作用对E2F1蛋白含量及E2F1下游靶分子的影响通过qRT-PCR和Western Blot分析检测SET7/9过表达或干扰表达前后E2F1mRNA表达变化与蛋白含量变化,以及E2F1过表达或干扰表达前后SET7/9 mRNA表达变化与蛋白含量变化,分析SET7/9与E2F1表达水平之间的调控关系以及与蛋白甲基化修饰的相关性。利用细胞浆核分离技术和免疫共沉淀法检测与分析SET7/9与E2F1蛋白的相互作用（互作）关系以及蛋白互作发生的细胞部位。查阅文献及公共数据库,找出E2F1下游的关键靶蛋白,通过Western Blot法检测SET7/9过表达与干扰表达后人肝细胞癌细胞内这些靶蛋白的表达变化以及与蛋白甲基化修饰的相关性,明确SET7/9介导的E2F1甲基化对下游信号通路分子的影响。5.统计学分析采用SPSS v20软件进行统计学检验。采用配对t检验比较人肝细胞癌组织和癌旁组织中SET7/9和E2F1表达水平,采用卡方（χ2）检验分析人肝细胞癌组织中SET7/9和E2F1表达水平与临床病理特征之间的相关性,采用单因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）与Tukey’s post-hoc检验比较过表达、干扰表达或MTA处理细胞与对照细胞在细胞增殖、迁移和侵袭等方面能力差异的显着性,以P<0.05为具有统计学意义。结果:1.SET7/9在人肝细胞癌组织中的表达与临床特征相关性分析免疫组化结果显示,68例临床肝细胞癌组织标本中,86.80%（59例/68例）标本中SET7/9蛋白水平增加或明显增加,SET7/9高表达率为77.94%（53例/68例）。统计学分析发现,肝细胞癌患者癌组织标本中SET7/9表达水平与年龄、性别、淋巴结转移和远端转移之间无相关性,但与肝细胞癌原发灶大小与范围（P<0.05）以及病理分期（P<0.05）有相关性。2.E2F1在人肝细胞癌组织中的表达与临床特征相关性分析免疫组化结果显示,68例临床肝细胞癌组织标本中,85.29%（58例/68例）标本中E2F1蛋白水平增加或明显增加,E2F1高表达率为64.71%（44例/68例）。统计学分析发现,肝细胞癌患者癌组织标本中E2F1表达水平与年龄、性别和远端转移之间无相关性,但与肝细胞癌原发灶大小与范围（P<0.05）、淋巴结转移（P<0.05）以及病理分期（P<0.05）相关。入组肝细胞癌组织标本中,SET7/9与E2F1两者表达变化一致的比例为79.41%（54例/68例）。3.SET7/9、E2F1在人肝细胞癌细胞株中过表达或干扰表达后对细胞功能的影响及其与甲基化修饰的相关性Western Blot检测结果显示HepG2、Huh7、SMMC-7721和Bel-7404四株人肝细胞癌细胞SET7/9蛋白表达均高于LO2株人正常肝细胞中SET7/9蛋白水平,但程度有所不同,其中Bel-7404和HepG2细胞SET7/9水平相对较低,而Huh7和SMMC-7721细胞SET7/9水平相对较高;E2F1表达与SET7/9类似,Bel-7404与HepG2细胞E2F1表达较低,而Huh7和SMMC-7721细胞E2F1表达较高。结合SET7/9与E2F1在不同细胞株中表达水平和细胞培养的综合情况,本文选取Bel-7404细胞株进行后续过表达相关的实验研究,选取Huh7细胞株进行后续干扰表达相关的实验研究。对Bel-7404和Huh7两株人肝细胞癌细胞分别进行过表达或干扰表达处理,获得SET7/9过表达Bel-7404-SET7/9人肝细胞癌细胞株和SET7/9干扰表达Huh7-shRNA-SET7/9人肝细胞癌细胞株。通过Western Blot法检测过表达或干扰表达细胞中SET7/9表达水平,验证过表达和干扰表达效率。CCK8检测结果显示,与对照相比,Bel-7404-SET7/9细胞增殖能力升高（P<0.05）,而Huh7-shRNA-SET7/9细胞增殖能力降低（P<0.05）。Transwell侵袭小室实验和划痕愈合实验结果表明,Bel-7404-SET7/9细胞侵袭和迁移能力增强（P<0.05）,而Huh7-shRNA-SET7/9细胞侵袭和迁移能力则降低（P<0.05）。对Bel-7404和Huh7两株人肝细胞癌细胞分别进行过表达或干扰表达处理,获得E2F1过表达Bel-7404-E2F1人肝细胞癌细胞株和E2F1干扰表达Huh7-shRNA-E2F1人肝细胞癌细胞株。通过Western Blot法检测过表达或干扰表达细胞中E2F1表达水平,验证过表达和干扰表达效率。CCK8检测结果显示,与对照相比,Bel-7404-SET7/9细胞增殖能力升高（P<0.05）,而Huh7-shRNA-SET7/9细胞增殖能力则降低（P<0.05）。Transwell侵袭小室实验和划痕愈合实验结果表明,Bel-7404-E2F1细胞体外侵袭和迁移能力增强（P<0.05）,而Huh7-shRNA-SET7/9细胞体外侵袭迁移能力则降低（P<0.05）。上述SET7/9与E2F1两者干扰表达实验结果均与蛋白甲基化抑制剂MTA处理细胞结果相似,体现出前两者效应与蛋白分子甲基化修饰的相关性。4.人肝细胞癌中SET7/9介导的甲基化作用对E2F1蛋白含量及E2F1下游靶分子的调控作用Western Blot和qRT-PCR结果显示,人肝细胞癌中SET7/9过表达或干扰表达后,E2F1 mRNA表达并无显着变化,但蛋白含量却明显降低,这与经蛋白甲基化抑制剂MTA处理后细胞中E2F1 mRNA表达变化和蛋白含量变化一致。相反,人肝细胞癌中E2F1过表达或干扰表达后,SET7/9 mRNA与蛋白含量均无显着变化。免疫共沉淀分析显示SET7/9与E2F1在细胞质中具有直接的互作关系,而在细胞核中未见两者存在相互作用。Western Blot结果表明:SET7/9过表达细胞中E2F1及其下游关键靶蛋白因子cyclin E1、cyclin A2和CDK2蛋白含量均增加,而SET7/9干扰表达细胞中E2F1以及cyclin E1、cyclin A2和CDK2蛋白含量均降低。该SET7/9干扰表达实验结果与蛋白甲基化抑制剂MTA处理细胞结果相似,表明前者效应与蛋白分子甲基化修饰相关。结论:1.SET7/9在人肝细胞癌组织中高表达,且其表达水平与原发灶大小与范围以及病理分期显着相关。2.E2F1在人肝细胞癌组织中与SET7/9呈一致性高表达,且与原发灶大小与范围、淋巴结转移和病理分期显着相关。3.SET7/9通过调控E2F1翻译后甲基化状态促进人肝细胞癌细胞增殖、侵袭和转移。4.SET7/9介导的E2F1甲基化会改变E2F1含量及其下游靶蛋白分子E1、cyclin A2和CDK2表达水平,影响肝细胞癌细胞生物学行为。本研究创新之处:1.揭示了SET7/9和E2F1在人肝细胞癌临床标本中表达水平与相关性及临床意义;2.揭示了SET7/9和E2F1在人肝细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用及其与蛋白甲基化修饰的相关性;3.揭示了SET7/9介导E2F1甲基化途径调控人肝细胞癌恶性表型的新机制。
袁陆[5]（2017）在《人类新基因AC3-33可变剪接体的鉴别和功能分析》文中研究指明目的RNA选择性剪接体不仅增加了mRNA表达多样性,在基因功能调节中也起着重要作用。在本研究中,我们基于表达序列标签的引物,利用MCF-7乳腺癌细胞系通过逆转录PCR（RT-PCR）成功地克隆了一个新的AC3-33可变剪接体（NCBI参考序列:NM001308229.1）,我们对其命名为svAC3-33。通过研究svAC3-33的基本结构和功能,以及进一步探讨其作用机制。希望为乳腺癌的临床诊断和治疗提供理论基础,为基因治疗提供新思路。方法1 svAC3-33生物信息学分析:通过DNAMAN、BioGPS等生物信息学软件分析预测基因的定位,信号肽相关信息;对svAC3-33的cDNA和相应的蛋白质序列比对;分析其在第三号染色体上外显子与内含子的位置信息。2重组载体的构建:把目的基因svAC3-33插入到表达绿色荧光蛋白的p EGFP-C3载体上,构建真核表达载体;构建沉默子质粒si-svAC3-33及其空白对照si-NC质粒。3细胞亚定位分析:倒置荧光显微镜检测GFP-sv-AC3-33融合蛋白的细胞亚定位。4细胞增殖检测:利用CCK-8技术检测细胞生长活力,绘制生长活力曲线;利用Edu实验检测细胞增殖情况,分析svAC3-33的过表达对MCF-7细胞的增殖影响。5利用Transwell实验测定svAC3-33及si-svAC3-33对细胞迁移的影响。6荧光素酶活性检测各个转录因子的活性,筛选出svAC3-33能抑制转录因子AP-1的活性,并进一步利用荧光素酶活性检测转录因子AP-1的活性表达情况。7 Western blot分析svAC3-33及si-svAC3-33对C-JUN和C-FOS表达的影响。8通过实时荧光定量qRT-PCR,检测在MCF-7细胞中过表达svAC3-33后P15,P21,P27,P53,cyclin-D1的表达水平。9实时荧光定量qRT-PCR检测在MCF-7细胞中沉默svAC3-33后,P21的转录水平表达情况。结果1该基因序列全长1825bp,由5个外显子和4个内含子组成,定位于3q25.31,CDS区域为共884bp编码294个氨基酸,比AC3-33多编码43个氨基酸。2本研究首先PCR证明了在MCF-7细胞中表达可变剪接体svAC3-33。3通过对svAC3-33和AC3-33外显子与内含子的位置信息比对发现svAC3-33缺少了Exon2。4成功的构建了重组质粒p EGFP-C3-svAC3-33,并验证了其在MCF-7细胞中表达;成功的构建了沉默子质粒si-svAC3-33及其空白对照si-NC质粒;Western blot结果表明si-svAC3-33构建成功并在MCF-7细胞中表达。5确定svAC3-33蛋白的细胞亚定位主要在细胞质。6通过CCK-8实验证实过表达svAC3-33对MCF-7细胞数目有显着地抑制作用,si-svAC-33沉默内源性svAC3-33表达后,细胞数目明显增加。7通过Edu实验证实过表达svAC3-33,处于S期的MCF-7细胞数目显着减少,细胞增殖速度显着减慢;与此相反,转染沉默子sisvAC3-33质粒组较空载si-NC质粒组,处于S期的MCF-7细胞数目显着增加。8通过Transwell实验验证了svAC3-33能明显的抑制MCF-7细胞迁移,而用RNA干扰技术沉默sv-AC3-33的表达后可以明显的促进MCF-7细胞迁移。9双荧光素酶活性实验检测结果表明,在MCF-7细胞中过表达svAC3-33能抑制转录因子AP-1的活性。而沉默svAC3-33后能促进AP-1的活性。10 Western blot结果表明,在MCF-7细胞中过表达svAC3-33,C-JUN的蛋白表达水平显着地被抑制,而与之相比C-FOS则没有明显的差异。11实时荧光定量RT-PCR结果表明,在MCF-7细胞中过表达svAC3-33,P21的转录活性显着增加,如果降低sv-AC3-33的表达量,会使P21的表达下调。结论sv-AC3-33基因序列全长1825 bp,由5个外显子和4个内含子组成,与AC3-33相比较缺少第二个外显子,定位于3q25.31,CDS区域为共884bp编码294个氨基酸。PCR证明了AC3-33可变剪接体svAC3-33的存在;确定sv-AC3-33蛋白的细胞亚定位主要在细胞质;证实svAC3-33对MCF-7细胞增殖的抑制作用,能明显的抑制细胞迁移;通过双荧光素酶活性实验检测各个转录因子的活性,发现svAC3-33能抑制转录因子AP-1的活性;进一步实验表明是C-JUN的蛋白表达水平显着地被转染svAC3-33组抑制,而与之相比C-FOS组则没有明显的差异;此外,我们发现svAC3-33可上调P21的表达。通过实时荧光定量qRT-PCR,发现降低sv-AC3-33的表达量,会使P21的表达下调。综上所述,我们的实验结果表明svAC3-33通过调节AP-1信号通路进而抑制MCF-7细胞的增殖,为乳腺癌的防治提供了一定理论基础。图23幅;表12个;参82篇。
王晓娇[6]（2015）在《Ezrin和P21在乳腺癌中的表达及临床意义》文中研究说明目的:通过检测Ezrin蛋白和P21蛋白在正常乳腺组织、导管内癌及浸润性乳腺癌中的表达,探讨其表达水平在三种组织中是否存在差异,并研究Ezrin蛋白及P21蛋白的表达与浸润性乳腺癌临床特性、病理指标是否存在相关性,进一步研究Ezrin及P21在浸润性乳腺癌中的表达水平与乳腺癌的复发转移和预后的相关性。材料与方法:随机选取2012年1月至2014年1月南昌大学第一附属医院病理科组织蜡块标本94例,其中正常乳腺组织22例,乳腺导管内癌32例,浸润性乳腺癌40例。所有标本都具有完整的临床病理资料,临床随访资料完整,术前均未经过任何放化疗及内分泌治疗,均为第一次手术。采用Envision免疫组织化学方法检测标本中Ezrin和P21的表达水平,结合临床病理参数进行分析。结果:1.浸润性乳腺癌组织中Ezrin的阳性细胞表现为胞质中弥漫性棕黄色和棕褐色颗粒。40例乳腺癌中Ezrin阳性表达率72.5%（29/40）,导管内癌Ezrin阳性表达率为40.7%（13/32）,Ezrin主要弥散在胞质内,表现为棕黄色或棕褐色,部分存在导管上皮细胞膜,呈浅黄色淡染。正常乳腺组织中Ezrin主要定位于乳腺导管上皮细胞膜,表现为细胞膜呈浅黄色,胞质中阳性表达率13.6%（3/22）。浸润性乳腺癌、导管内癌、正常乳腺组织中Ezrin的表达逐渐降低,三组之间两两比较,差异具有统计学意义。2.P21阳性表现为细胞核或胞核伴有胞浆出现棕黄色颗粒,单纯胞浆中出现黄色颗粒为阴性。在浸润性乳腺癌中阳性表达率为67.5%（27/40）,导管内癌中阳性表达率为34.4%（11/32）,乳腺正常组织阳性表达率为13.6%（3/22）。三组之间两两比较,差异具有统计学意义。浸润性乳腺癌、导管内癌、正常乳腺组织中P21的表达逐渐降低,差异具有统计学意义。3.临床Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌Ezrin阳性表达率91.7%（11/12）,临床Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌的Ezrin阳性率64.3%（18/28）,差异具有统计学意义（P<0.01）;淋巴结转移≥4枚乳腺癌患者的Ezrin阳性表达率100%,淋巴结转移<4枚乳腺癌患者的Ezrin阳性表达率为46.4%（13/28）,差异具有统计学意义（P<0.01）。临床Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌患者的P21阳性表达率为33.3%（4/12）,临床Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌患者的P21阳性表达率82.1%（23/28）,差异具有统计学意义（P<0.01）。4.Ezrin和P21在乳腺浸润性癌组织中均高表达,Ezrin在有淋巴结转移的乳腺癌中这种异常表达更明显,且两者的异常高表达之间呈正相关（r=0.023,P=0.046）。5.乳腺癌组织中Ezrin的表达与组织学分级（P=0.014,rp=0.406）、淋巴结转移（P=0.023,rp=0.406）、年龄呈正相关（P=0.006,rp=0.321）,与PR呈负相关（P=0.022,rp=0.340）;乳腺癌组织中P21的表达与PR正相关（P=0.027,rp=0.321）;TNM分期（P=0.022,rp=0.395）、组织学分级（P=0.033,rp=0.320）、Her-2呈负相关（P=0.018,rp=0.395）;乳腺癌组织中P21和Ezrin表达在月经状态、肿瘤大小、ER、Ki-67无相关性;乳腺癌中Ezrin与P21无明显相关。结论:1.Ezrin在乳腺良恶性病变组织中有明显不同的亚组织定位,其表达情况对乳腺病变性质的判断具有重要价值。P21蛋白在乳腺癌中明显高表达,主要分布于细胞的胞核中,偶尔分布于胞浆中。Ezrin蛋白在浸润性乳腺癌、导管内癌、乳腺正常组织中表达依次降低,差异具有统计学意义,P21蛋白在浸润性乳腺癌、导管内癌、乳腺正常组织中表达依次降低,差异具有统计学意义。2.Ezrin和P21在浸润性导管癌表达明显高于导管内癌,说明Ezrin和P21在乳腺浸润性导管癌中的发生、发展中可能是协同因素,共同促进肿瘤恶变、转移等生物学行为。3.乳腺癌组织中Ezrin的表达与组织学分级、淋巴结转移呈正相关,PR负相关;P21的表达与PR呈正相关,与TNM分期、组织学分级、Her-2呈负相关,说明其与乳腺癌进展、转移及预后相关,其联合检测可作为判断乳腺癌预后的指标,也为乳腺癌靶向治疗提供一定的参考价值。
许沈华,毛伟敏,葛明华,高永良,凌志强,林能明,高赟[7]（2013）在《基础研究与临床应用——浙江省肿瘤医院科研发展历程》文中认为全文记述浙江省肿瘤医院、浙江省肿瘤研究所的科研发展历程。多年来医院和研究所科研取得巨大进步,获得的科研成果有:①大肠癌研究建细胞系填补国内空白。②建卵巢癌模型提供研究转移理想工具。③胃癌基础与临床研究达国内外先进水平。④肺癌早期诊断和个性化治疗起示范作用。⑤头颈部恶性肿瘤转化型研究不断推进。⑥乳腺癌个体化治疗迈入分子靶向时代。⑦食管癌研究推陈出新前景辉煌。
李新白[8]（2012）在《生物钟基因Npas2在乳腺癌发生中的作用及刺五加黄酮对生物钟基因表达的影响和抗肿瘤机制》文中研究说明(1)生物钟基因Npas2在人乳腺癌中的表达及其临床意义目的：研究生物钟基因Npas2在乳腺癌中的表达，探讨其与乳腺癌发生、发展的关系。方法：应用免疫组织化学技术分析30例乳腺浸润癌、20例瘤旁正常乳腺组织、20例乳腺癌前病变（小叶原位癌10例和乳管内乳头状瘤10例）和20例乳腺纤维瘤中Npas2的表达情况。其中对10例乳腺小叶原位癌和30例乳腺浸润癌按国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行分期，其中T0期10例，I期9例、II期16例和III期5例；有淋巴结转移者11例，无淋巴结转移者19例。采用Motic Images Advanced3.2图像分析仪，在200倍镜下连续观察5个视野检测，测量灰度值，以灰度值表示Npas2蛋白阳性表达的高低，灰度值越小，说明Npas2蛋白阳性表达越高；灰度值越大，说明Npas2蛋白阳性表达越低。结果：Npas2蛋白在正常乳腺组织、乳腺癌前病变和浸润癌中均有表达，特异性着色位于细胞浆内，呈棕色颗粒。Npas2蛋白在正常乳腺组织中呈阳性表达，其灰度值为（114.3±2.31），在浸润癌中表达明显降低，呈淡黄色或着色较浅，其灰度值（159.5±6.79），两组比较差异有显着性意义。在乳腺癌前病变中呈阳性表达，其抗体灰度值为（132.3±2.11），在乳腺纤维瘤中Npas2表达明显减弱或不表达，其灰度值（206.3±3.02）；在I期、II期和III期乳腺浸润癌中Npas2的表达依次降低，其抗体灰度值分别为（142.3±2.46），（161.2±4.22）和（176.3±2.93）。与T0期和I期乳腺癌比较，在II期和III期乳腺癌中Npas2表达明显减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。在乳腺浸润癌中，无淋巴结转移组和有淋巴结转移组Npas2表达的灰度值分别为（156.8±3.23）和（166.3±4.04），两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。考虑可能纳入的样本数不够有关。结论：Npas2在乳腺癌中表达明显下调，与乳腺癌的发生、病理和临床分期关系密切。Npas2低表达与肿瘤瘤体大小、浸润深度有关，Npas2高表达可能是在乳腺癌发展中具有保护性作用。在乳腺癌癌前病变中Npas2表达增强，提示其可能在阻止癌前病变恶变中发挥作用。Npas2功能降低可能是乳腺癌发生的一个重要因素。（2）刺五加黄酮对MCF-7细胞系中Npas2和Per2表达的影响和抗肿瘤机制目的：通过检测刺五加黄酮对MCF-7细胞中Npas2和Per2的表达和对MCF-7细胞生长抑制作用以及对细胞增殖、凋亡相关蛋白表达和基因组稳定性的影响，探讨刺五加黄酮调节昼夜节律和抗肿瘤的机制。方法：采用MTT法检测不同浓度的刺五加黄酮对MCF-7细胞生长抑制作用；应用流式细胞仪检测刺五加黄酮对MCF-7细胞周期的影响；采用实时定量PCR的方法检测不同浓度的刺五加黄酮作用MCF-7细胞，不同时间点细胞周期相关蛋白Cyclin D1和P21转录的影响；应用免疫荧光染色方法检测刺五加黄酮对MCF-7细胞生物钟基因Npas2和Per2表达的影响，采用软件定量Npas2和Per2的荧光表达强度。采用Tunel细胞凋亡检测方法观察不同浓度的刺五加黄酮对MCF-7细胞凋亡的诱导作用，细胞凋亡指数评估采用同一视野中凋亡阳性细胞的百分率显示。采用免疫荧光法检测刺五加黄酮对MCF-7细胞Bax、Bcl-2和c-myc等凋亡相关蛋白表达水平的影响。采用实时定量PCR法观察Brg1转录水平的变化和采用免疫荧光法检测对Brg1蛋白表达的影响。采用Western Blotting方法检测刺五加黄酮作用MCF-7细胞，在6h、12h和24h时间点的总pRb和磷酸化pRb蛋白的表达变化。图像分析扫描蛋白条带灰度，以细胞内总pRb蛋白-磷酸化pRb蛋白灰度为去磷酸化pRb表达量，以ppRb/pRb和（pRb-ppRb）/pRb进行半定量分析。结果：浓度为100μmol/L的刺五加黄酮可使MCF-7细胞中Npas2和Per2表达强度明显增加（p<0.01），能抑制MCF-7细胞在体外的增殖，且抑制作用有明显的剂量和时间依赖性。作用24h后在浓度低于75μmol/L时对MCF-7细胞生长没有抑制作用，甚至其抑制细胞生长作用反而下降，出现促进细胞增殖的现象；作用48h后抑制MCF-7细胞生长的浓度提前到75μmol/L。浓度为100μmol/L的刺五加黄酮作用MCF-7细胞后，使G1期细胞增多，S细胞减少，G2/M期细胞减少，表明刺五加黄酮既可阻止细胞由G1期进入S期，也可阻止进入分裂期，抑制细胞有丝分裂，表明刺五加黄酮可能通过改变细胞周期来抑制肿瘤细胞生长。浓度为50μmol/L刺五加黄酮作用MCF-7细胞24h后Cyclin D1基因转录水平明显增高，100μmol/L刺五加黄酮作用后Cyclin D1基因转录水平明显增高，且时间提前到6h，12h下降到正常水平。P21基因转录水平与刺五加黄酮的浓度无关，早期6h时间点转录增强，12-24h表达水平下降。正常培养的MCF-7细胞，偶见细胞凋亡阳性细胞，浓度为50μmol/L刺五加黄酮作用后细胞凋亡指数为0.8%，100μmol/L后细胞凋亡指数增加为5.2%，200μmol/L后细胞凋亡指数为12.6%，结果表明浓度为200μmol/L刺五加黄酮能诱导MCF-7细胞发生凋亡（p<0.01）。随着刺五加黄酮剂量增加，细胞凋亡指数也增加。浓度为100μmol/L的刺五加黄酮作用后，采用软件定量荧光表达强度显示Bax表达强度明显增加（p<0.01），Bcl-2表达强度明显减弱（p<0.01），c-myc蛋白表达强度明显减弱，Bax/Bcl-2比值明显增加。浓度为50和100μmol/L刺五加黄酮使Brg1基因转录6h有增高的趋势，12h时达峰值（p<0.01），24h降至正常水平以下。100μmol/L的刺五加黄酮作用MCF-7细胞12h和24h后磷酸化pRb蛋白表达下降，去磷酸化的pRb蛋白增加，有明显统计学差异（p<0.05）。结论：1.浓度为100μmol/L的刺五加黄酮可使MCF-7细胞Npas2和Per2蛋白表达增强，Npas2和Per2蛋白表达增强可能是刺五加黄酮调整昼夜节律和抗肿瘤的机制；2.浓度为150μmol/L的刺五加黄酮在体外抑制MCF-7细胞增殖，通过改变细胞周期和调控细胞周期蛋白Cyclin D1和P21的表达抑制肿瘤细胞的增殖；3.浓度为200μmol/L刺五加黄酮可诱导细胞凋亡，通过下调抑制凋亡基因Bcl-2及上调促凋亡基因Bax的表达来诱导细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤的作用；4.浓度100μmol/L刺五加黄酮可促进MCF-7细胞Brg1、Npas2和Per2等基因的表达，提示生物钟基因Npas2和Per2及抑癌基因Brg1可能在乳腺癌发生中发挥作用。浓度为100μmol/L刺五加黄酮使MCF-7细胞pRB处于低磷酸化状态，调控细胞周期调控点使细胞周期停滞，使细胞有时间进行修复，维持DNA稳定，提示刺五加黄酮可能在维持基因组稳定性中发挥作用。
王建杰[9]（2012）在《重组人乳铁蛋白抗乳腺癌作用及其机制研究》文中认为乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在发达国家占女性恶性肿瘤的第一位。乳腺癌的基因治疗是除了外科手术、化疗和放疗的另一个很有前景的治疗方式，它能将肿瘤抑制基因、抑癌因子或其他抗癌药物直接送达肿瘤部位靶向杀伤肿瘤细胞，因而备受学者关注。乳铁蛋白（Lactoferrin，LTF）具有抗肿瘤作用，能明显抑制多种器官肿瘤的发生、生长和转移，被广泛认为是一种新型的抗癌药物。在前期的研究工作中，我们构建了含有人乳铁蛋白cDNA和绿色荧光蛋白基因（GFP）作为报告基因的重组人乳铁蛋白腺病毒载体（ad-rhLTF），并证明ad-rhLTF在羊乳汁和兔乳汁中均获得人LTF（hLTF）的高表达。然而，有关ad-rhLTF的其他生物学活性尤其对乳腺癌的作用及机制仍然不十分清楚。因此，本研究采用体内、体外试验，较系统地研究了ad-rhLTF对乳腺癌的作用及其抑癌机制。在体内试验中，首先建立小鼠EMT6乳腺癌移植瘤模型，并随机分为阴性对照组、环磷酰胺阳性药物对照组、ad-rhLTF低剂量组（108pfu/mL）和ad-rhLTF高剂量组（5×108pfu/mL）。采用免疫组织化学法、ELISA、流式细胞技术、RT-PCR、Western blot方法等，对ad-rhLTF可能的抗乳腺癌作用及机制从调节免疫功能、干扰肿瘤细胞周期以及诱导肿瘤细胞凋亡等方面进行了系统地研究。获得如下结果：Ad-rhLTF不同剂量肿瘤注射14d后，发现hLTF在小鼠肿瘤组织中出现高表达,以高剂量组更为明显。Ad-rhLTF低、高剂量均能明显地抑制小鼠肿瘤的生长（p<0.01），肿瘤抑制率分别为42.80%和52.64%。并证明ad-rhLTF减少了肿瘤组织中突变型p53、CerbB-2和Ki-67蛋白的阳性细胞百分率（p<0.01），且肝脏、肾脏组织形态及功能均未见异常。通过对肿瘤细胞周期分析，ad-rhLTF能增加肿瘤细胞在G0/G1期的数目（p<0.01），减少S期和G2/M期的百分数（p<0.01），并出现Sub-G1期凋亡峰，凋亡百分数达到19.58%（ad-rhLTF高剂量组），证明ad-rhLTF通过干扰细胞周期发挥抗肿瘤作用。同时，小鼠肿瘤组织中Bcl-2mRNA和蛋白表达均减少（p<0.01），而Bax、Fas、Caspse3mRNA和蛋白表达均明显增加（p<0.01），证明ad-rhLTF诱导凋亡是通过启动了凋亡的线粒体途径和死亡受体途径进而引起caspase3的活化。试验也发现，ad-rhLTF处理组肿瘤组织中p53mRNA表达增加，PKB和PKC蛋白表达减少（p<0.01），证明p53、PKB和PKC参与调节凋亡过程。通过对小鼠免疫功能的研究发现，ad-rhLTF高剂量明显地提高了荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数（p<0.05），而ad-rhLTF低剂量对胸腺指数和脾指数无显着影响（p＞0.05）。Ad-rhLTF增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力和NK细胞的杀伤活性（p<0.05，p<0.01），刺激小鼠脾细胞增殖（p<0.01），增加了外周血CD4+T细胞的比例（p<0.05），有效地纠正了肿瘤发生时CD4+T与CD8+T细胞比例的倒置。刺激小鼠脾细胞分泌IL-2、腹腔巨噬细胞分泌TNF-α （p<0.05）。外周血单个核细胞（PBMC）中的IL-2、TNF-α的mRNA表达水平上升（p<0.01），血清中的IL-2和TNF-α表达增加（p<0.05），从而发挥细胞因子的抗肿瘤作用。此外，ad-rhLTF处理组PBMC中B7-1和B7-2分子mRNA表达上调（p<0.01），脾细胞核转录因子NF-κB和AP-1高表达（p<0.01），则促进T细胞克隆增殖，增强了抗肿瘤免疫。在MCF-7细胞体外培养试验中，ad-rhLTF作用于MCF-7细胞72h的IC50为100pfu/cell。Ad-rhLTF转染MCF-7细胞72h后, ad-rhLTF对MCF-7细胞具有明显的细胞毒作用，抑制了MCF-7细胞的增殖，并且经光镜、荧光染色和电镜观察MCF-7细胞出现了典型的凋亡形态学特征。经过Annexin V-FITC流式检测，ad-rhLTF明显增加MCF-7的凋亡细胞数，凋亡率达到31.92%（100pfu/cell）。细胞经琼脂糖凝胶电泳出现DNA“梯状”条带，细胞线粒体膜电位显着下降。Ad-rhLTF阻滞MCF-7细胞周期在G0/G1期。Ad-rhLTF也导致了Bcl-2mRNA的减少和Bax mRNA表达的增加（p<0.01），从而证明ad-rhLTF诱导MCF-7的凋亡机制与线粒体途径有关。本文通过体内、外试验对ad-rhLTF的抗乳腺癌的作用及相关机制进行了较深入地研究，为ad-rhLTF在肿瘤靶向治疗领域的应用提供了理论基础。
陈亚民,宋蔚青[10]（2011）在《乳腺癌相关基因表达及其临床意义》文中研究指明近年来,随着分子生物学的发展,各地相继开展了一些乳腺癌的相关基因及蛋白的检测项目,如ER、PR、HER-2、p53、Ki67等。但各个地区、各个医院检测内容却不尽一致,且临床上
二、乳腺癌中P21基因产物的表达及其临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳腺癌中P21基因产物的表达及其临床意义（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA lnc-Z38对胃癌发生发展的调控作用和相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号及中英文说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 lncRNAZ38在胃癌组织和细胞株中的表达及其临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 lncRNAZ38对胃癌细胞生物学效应的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 lncRNAZ38参与胃癌发生发展的分子机制初步探讨 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（2）MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MYC在乳腺癌组织中的表达及其临床意义 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂及制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 组织样本的收集 |
| 2.2 石蜡标本的制备 |
| 2.3 组织切片的苏木精-伊红染色(HE染色) |
| 2.4 免疫组织化学技术(IHC)检测组织中MYC表达水平 |
| 2.5 随访 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MYC蛋白在乳腺癌组织、癌旁正常组织中的表达 |
| 3.2 MYC阳性表达与乳腺癌临床病理特征的关系 |
| 3.3 MYC阳性表达与乳腺癌预后的关系 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 MYC对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养方法 |
| 2.2 慢病毒转染及效率测定 |
| 2.3 RT-PCR检测mRNA表达 |
| 2.4 Western blot法检测蛋白表达 |
| 2.5 克隆形成实验检测细胞增殖 |
| 2.6 MTT法检测细胞增殖能力 |
| 2.7 TUNEL法分析细胞凋亡 |
| 2.8 流式细胞仪法检测细胞凋亡 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MYC野生型与突变型(T58A)转染后转染效率测定 |
| 3.2 MYC野生型与突变型(T58A)对细胞增殖的影响 |
| 3.3 MYC野生型与突变型(T58A)对细胞凋亡的影响 |
| 3.4 MYC野生型与突变型(T58A)转染后各相关凋亡蛋白表达 |
| 3.5 MYC野生型与突变型(T58A)转染后Bim的表达 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 分析MYC在p53缺失情况下对Bim的调控作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要实验仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂及制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 慢病毒转染 |
| 2.2 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 转染后p21和Bim的表达 |
| 3.2 干扰p21后对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3 转染后p14和Bim的表达 |
| 3.4 干扰p14后对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）FOXP3与Galectin-1的相互作用拮抗FOXP3抑癌功能及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 FOXP3 在乳腺癌中的表达情况及其临床意义 |
| 引言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 FOXP3与Gal-1 相互作用的验证 |
| 引言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 FOXP3与Gal-1 相互作用对FOXP3 抑癌功能的影响及其机制研究 |
| 引言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 Gal-1 在乳腺癌细胞核内高表达及其机制初探 |
| 引言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）SET7/9介导E2F1甲基化途径调控肝细胞癌恶性表型及相关机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 (Abbreviations) |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一部分 临床研究 |
| 第一章 SET7/9在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 入组标本来源与相关患者临床资料 |
| 1.1.2 组织标本处理 |
| 1.1.3 免疫组织化学检测(IHC) |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 SET7/9在肝细胞癌组织与癌旁组织中的表达状况 |
| 1.2.2 SET7/9表达水平与患者临床特征之间的相关性 |
| 第二章 E2F1在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 入组标本来源与相关患者临床资料 |
| 2.1.2 组织标本处理 |
| 2.1.3 免疫组化检测 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 E2F1在肝细胞癌组织与癌旁组织中的表达状况 |
| 2.2.2 E2F1表达水平与患者临床特征之间的相关性 |
| 第二部分 基础研究 |
| 第三章 SET7/9或E2F1表达变化对肝细胞癌细胞功能的影响及其与甲基化修饰的关系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞培养 |
| 3.1.2 质粒构建和细胞转染 |
| 3.1.3 Western Blot分析 |
| 3.1.4 体外细胞功能分析 |
| 3.1.5 统计学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 SET7/9与E2F1 在肝细胞癌细胞中的表达状况 |
| 3.2.2 SET7/9 表达变化对肝细胞癌细胞功能的影响及其与甲基化修饰的关系 |
| 3.2.3 E2F1 表达变化对肝细胞癌细胞功能的影响及其与甲基化修饰的关系 |
| 第四章 肝细胞癌细胞中SET7/9 介导E2F1 甲基化途径的分子机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.2 RNA提取和q RT-PCR |
| 4.1.3 Western Blot分析 |
| 4.1.4 亚细胞分离和免疫共沉淀 |
| 4.1.5 统计学分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SET7/9与E2F1 两者蛋白相互作用关系 |
| 4.2.2 人肝细胞癌细胞中SET7/9甲基化作用对E2F1蛋白含量的影响 |
| 4.2.3 SET7/9 介导的E2F1 甲基化对E2F1 下游靶蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）人类新基因AC3-33可变剪接体的鉴别和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 svAC3-33基因的结构、细胞亚定位分析及重组蛋白的表达和鉴定 |
| 1.1 实验材料设备及试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 生物信息学分析 |
| 1.2.2 聚合酶链式反应(PCR)证明svAC3-33 的存在及片段大小 |
| 1.2.3 过表达载体的构建 |
| 1.2.4 svAC3-33沉默子质粒的构建 |
| 1.2.5 svAC3-33的亚细胞定位 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 svAC3-33生物信息学分析结果 |
| 1.3.2 聚合酶链式反应(PCR)证明svAC3-33 的存在及片段大小 |
| 1.3.3 重组质粒pEGFP-C3-svAC3-33 的构建 |
| 1.3.4 western blot检测pEGFP-C3-svAC3-33及pEGFP-C3 蛋白的含量 |
| 1.3.5 沉默子si-svAC3-33 及其空白对照质粒的构建 |
| 1.3.6 western blot检测沉默子si-svAC3-33在MCF-7 细胞中的表达 |
| 1.3.7 pEGFP-C3-svAC3-33 的细胞亚定位分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 svAC3-33基因的功能及初步分子机制的探讨 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 CCK-8 实验测定svAC3-33 对细胞增殖的影响 |
| 2.1.2 Edu细胞增殖实验实验测定其对细胞增殖的影响 |
| 2.1.3 Transwell实验测定svAC3-33 对细胞迁移的影响 |
| 2.1.4 双荧光素酶活性检测各个转录因子的活性 |
| 2.1.5 双荧光素酶活性转录因子AP-1的活性检验 |
| 2.1.6 Western blot实验分析svAC3-33对C-JUN,C-FOS的作用 |
| 2.1.7 MCF-7 细胞中P15,P21,P27,P53,cyclin-D1 转录水平表达的检测 |
| 2.1.8 MCF-7 细胞中svAC3-33在0,24及48 小时P21 转录水平表达检测 |
| 2.1.9 沉默svAC3-33在MCF-7 细胞中P21 的转录水平的影响 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CCK-8 实验测定svAC3-33 对细胞增殖的影响 |
| 2.2.2 Edu细胞增殖实验实验测定其对细胞增殖的影响 |
| 2.2.3 Transwell实验测定svAC3-33及si-svAC3-33 对细胞迁移的影响 |
| 2.2.4 荧光素酶活性检测转录因子AP-1的活性 |
| 2.2.5 Westernblot分析svAC3-33及si-svAC3-33对C-JUN,C-FOS的作用 |
| 2.2.6 MCF-7细胞中P21转录水平表达检测 |
| 2.2.7 沉默svAC3-33在MCF-7 细胞中对P21 的转录水平的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第3章 综述 P21基因与癌症关系的研究进展 |
| 3.1 P21的结构特点及其生物学作用 |
| 3.2 P21活性调节的生物学意义 |
| 3.3 P21与癌症 |
| 3.4 小结及应用展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（6）Ezrin和P21在乳腺癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 试剂配制及实验准备 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法及步骤 |
| 2.4 结果判断 |
| 2.5 统计方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 实验标本的临床特征与病理参数汇总（表 1） |
| 3.2 Ezrin与乳腺癌 |
| 3.2.1 乳腺癌、乳腺导管内癌、正常乳腺组织中Ezrin的表达情况 |
| 3.2.2 Ezrin在乳腺癌中的表达及与患者临床病理特点的关系。 |
| 3.3 P21 与乳腺癌 |
| 3.3.1 浸润性乳腺癌、乳腺导管内癌、正常乳腺组织中P21 蛋白表达情况 |
| 3.3.2 P21 蛋白在浸润性乳腺癌中的表达与临床病理特征之间的关系 |
| 3.4 P21 和Ezrin的相互关系 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 Ezrin与乳腺癌 |
| 4.1.1 Ezrin基因的结构与功能 |
| 4.1.2 Ezrin蛋白在浸润性乳腺癌、导管内癌、正常乳腺组织中的表达及与临床病理指标间的关系 |
| 4.1.3 Ezrin在乳腺癌中可能的作用机制 |
| 4.2 P21 与乳腺癌 |
| 4.2.1 P21 基因的结构和功能 |
| 4.2.2 P21 蛋白在乳腺癌、乳腺导管内癌、正常乳腺组织中的表达及其临床意义 |
| 4.2.3 P21 基因与疾病、肿瘤以及预后的关系 |
| 4.2.4. P21 蛋白在乳腺癌中可能存在的作用机制 |
| 4.3 Ezrin与P21 的关系 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 Ezrin与乳腺癌 |
| 5.2 P21 与乳腺癌 |
| 5.3 Ezrin与P21 的关系 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 1 |
| 参考文献 |
| 综述 2 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）基础研究与临床应用——浙江省肿瘤医院科研发展历程（论文提纲范文）
| 1 大肠癌研究建细胞系填补国内空白 |
| 2 建卵巢癌模型提供研究转移理想工具 |
| 3 胃癌基础与临床研究达国内外先进水平 |
| 4 肺癌早期诊断和个性化治疗起示范作用 |
| 5 头颈部恶性肿瘤转化型研究不断推进 |
| 6 乳腺癌个体化治疗迈入分子靶向时代 |
| 7 食管癌研究推陈出新前景辉煌 |
（8）生物钟基因Npas2在乳腺癌发生中的作用及刺五加黄酮对生物钟基因表达的影响和抗肿瘤机制（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 昼夜节律与生物钟基因 |
| 2.1.1 概述 |
| 2.1.2 昼夜节律的分子机制 |
| 2.2 昼夜节律与细胞周期 |
| 2.3 昼夜节律与细胞凋亡 |
| 2.4 昼夜节律与基因组稳定性 |
| 2.5 昼夜节律与肿瘤 |
| 第3章 Npas2 蛋白的生物学功能与乳腺肿瘤关系 |
| 第4章 生物钟基因 Npas2 在人乳腺癌中的表达及其临床意义 |
| 4.1 Npas2 在乳腺癌和乳腺正常组织中的表达 |
| 4.1.1 材料和方法 |
| 4.1.2 结果 |
| 4.1.3 讨论 |
| 4.2 Npas2 在乳腺纤维瘤和癌前病变中的表达 |
| 4.2.1 材料和方法 |
| 4.2.2 结果 |
| 4.2.3 讨论 |
| 4.3 Npas2 在各期乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系 |
| 4.3.1 材料和方法 |
| 4.3.2 结果 |
| 4.3.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 刺五加黄酮对 MCF-7 中生物钟基因 Npas2 和 Per2 表达的影响和抗肿瘤机制 |
| 5.1 刺五加黄酮对 MCF-7 细胞系生物钟基因表达及细胞增殖的影响 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 结果 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.2 刺五加黄酮对 MCF-7 细胞凋亡及凋亡基因表达的影响 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 结果 |
| 5.2.4 讨论 |
| 5.3 刺五加黄酮对 MCF-7 细胞染色质重排的影响 |
| 5.3.1 实验材料与方法 |
| 5.3.2 结果 |
| 5.3.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）重组人乳铁蛋白抗乳腺癌作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 乳腺癌的病因学和发病机制 |
| 1.2.1 病因学 |
| 1.2.2 发病机制 |
| 1.3 乳腺癌生物治疗的研究进展 |
| 1.3.1 乳腺癌基因治疗的策略和方向 |
| 1.3.2 基因治疗存在的问题和展望 |
| 1.3.3 乳铁蛋白的研究现状 |
| 1.3.4 重组人乳铁蛋白的转基因研究 |
| 1.3.5 重组人乳铁蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究进展 |
| 1.4 本文的主要研究内容 |
| 第2章 重组人乳铁蛋白抗小鼠乳腺癌作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 药品和试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物和细胞株 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 Ad-rhLTF 在 HEK293 细胞中的扩增 |
| 2.3.2 小鼠 EMT6 乳腺癌模型的建立 |
| 2.3.3 有效剂量和最大耐受量的确定 |
| 2.3.4 确定小鼠治疗剂量 |
| 2.3.5 试验动物分组及药物处理 |
| 2.3.6 小鼠一般状态观察 |
| 2.3.7 肿瘤生长抑制率测定 |
| 2.3.8 人乳铁蛋白在小鼠肿瘤组织中的表达 |
| 2.3.9 小鼠肝脏、肾脏病理学分析 |
| 2.3.10 小鼠血常规、肝功能和肾功能的检测 |
| 2.3.11 小鼠肿瘤组织细胞形态学的观察 |
| 2.3.12 小鼠肿瘤组织中 p53、CerbB-2 和 Ki-67 的表达 |
| 2.3.13 统计学数据处理 |
| 2.4 试验结果 |
| 2.4.1 Ad-rhLTF 在 HEK293 细胞中的扩增 |
| 2.4.2 小鼠 EMT6 乳腺癌模型的建立 |
| 2.4.3 Ad-rhLTF 的有效剂量和最大耐受量 |
| 2.4.4 小鼠一般情况的观察 |
| 2.4.5 Ad-rhLTF 对小鼠 EMT6 乳腺癌移植瘤生长的抑制作用 |
| 2.4.6 人 LTF 在小鼠肿瘤组织中的表达 |
| 2.4.7 肝脏、肾脏病理形态学检测结果 |
| 2.4.8 血常规和肝、肾功能的变化 |
| 2.4.9 肿瘤组织的病理学观察 |
| 2.4.10 肿瘤组织中突变型 p53、CerbB-2 和 Ki-67 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 应用腺病毒载体的评价 |
| 2.5.2 建立小鼠乳腺癌模型 |
| 2.5.3 Ad-rhLTF 成功转染 EMT6 小鼠乳腺癌细胞 |
| 2.5.4 Ad-rhLTF 抑制 EMT6 小鼠乳腺癌细胞生长的作用 |
| 2.5.5 Ad-rhLTF 抑制突变型 p53、CerbB-2 和 Ki-67 的表达 |
| 2.5.6 Ad-rhLTF 对 EMT6 荷瘤小鼠的毒副作用 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 Ad-rhLTF 诱导 EMT6 小鼠乳腺癌细胞凋亡作用及其机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 药品和试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.2.3 试验动物和细胞株 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 Ad-rhLTF 在 HEK293 细胞中的扩增 |
| 3.3.2 小鼠乳腺癌模型的建立和药物处理 |
| 3.3.3 人乳铁蛋白在小鼠肿瘤组织中的表达 |
| 3.3.4 肿瘤生长抑制率的测定 |
| 3.3.5 光学显微镜下观察肿瘤细胞凋亡形态学的变化 |
| 3.3.6 EMT6 小鼠肿瘤细胞凋亡的 TUNEL 染色 |
| 3.3.7 流式细胞技术检测肿瘤细胞周期和细胞凋亡 |
| 3.3.8 免疫组化法检测小鼠肿瘤组织 Bcl-2、Bax、PKB 和 PKC 的表达 |
| 3.3.9 肿瘤组织中总 RNA 提取及反转录 PCR |
| 3.3.10 肿瘤组织 p53、Bcl-2、Bax、Fas、FasL 和 caspase 3 mRNA 的表达 |
| 3.3.11 肿瘤组织 Bcl-2、Bax、Fas、FasL 和 caspase 3 的蛋白表达检测 |
| 3.3.12 统计学数据处理 |
| 3.4 试验结果 |
| 3.4.1 Ad-rhLTF 在 293 细胞中的扩增 |
| 3.4.2 人 LTF 在小鼠肿瘤组织中的表达 |
| 3.4.3 Ad-rhLTF 对小鼠体重和肿瘤生长的影响 |
| 3.4.4 Ad-rhLTF 对小鼠肿瘤细胞凋亡形态学的影响 |
| 3.4.5 TUNEL 染色检测小鼠肿瘤组织凋亡百分率 |
| 3.4.6 Ad-rhLTF 对小鼠肿瘤组织细胞周期的影响 |
| 3.4.7 免疫组化法检测肿瘤组织中 Bcl-2、Bax、PKB 和 PKC 表达 |
| 3.4.8 小鼠肿瘤组织的总 RNA 提取和鉴定 |
| 3.4.9 小鼠肿瘤组织 p53、Bcl-2、Bax、Fas、FasL、caspase 3 的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 Ad-rhLTF 诱导小鼠 EMT6 肿瘤细胞凋亡形态学改变 |
| 3.5.2 Ad-rhLTF 对 EMT6 荷瘤小鼠肿瘤细胞周期的影响 |
| 3.5.3 Ad-rhLTF 诱导肿瘤细胞凋亡分子机制 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 Ad-rhLTF 对 EMT6 小鼠免疫功能的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 药品和试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.2.3 试验动物和细胞株 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 EMT6 乳腺癌小鼠模型的建立 |
| 4.3.2 试验分组 |
| 4.3.3 荷瘤小鼠体重和肿瘤生长抑制率的测定 |
| 4.3.4 Ad-rhLTF 对荷瘤小鼠免疫器官的影响 |
| 4.3.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 |
| 4.3.6 小鼠 NK 细胞活性测定 |
| 4.3.7 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力的测定 |
| 4.3.8 小鼠外周血 T 淋巴细胞亚群的检测 |
| 4.3.9 脾细胞上清液中 IL-2 的检测 |
| 4.3.10 腹腔巨噬细胞分泌 TNF-α的检测 |
| 4.3.11 小鼠血清中 IL-2、TNF-α的含量测定 |
| 4.3.12 PBMC 中 IL-2、TNF-α和 B7 分子 mRNA 的检测 |
| 4.3.13 Western blot 检测小鼠脾细胞中 NF-κB、AP-1 的表达 |
| 4.3.14 统计学处理 |
| 4.4 试验结果 |
| 4.4.1 Ad-rhLTF 对乳腺癌荷瘤小鼠体重和肿瘤抑制率的影响 |
| 4.4.2 Ad-rhLTF 对小鼠免疫器官的影响 |
| 4.4.3 Ad-rhLTF 对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 |
| 4.4.4 小鼠 NK 细胞活性的变化 |
| 4.4.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖的情况 |
| 4.4.6 Ad-rhLTF 对小鼠外周血 T 淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.4.7 Ad-rhLTF 对脾细胞分泌 IL-2 和腹腔巨噬细胞分泌 TNF-α的影响 |
| 4.4.8 血清中 IL-2 和 TNF-α的变化 |
| 4.4.9 小鼠 PBMC 中 IL-2、TNF-α和 B7 分子 mRNA 的表达 |
| 4.4.10 小鼠脾细胞 NF-κB、AP-1 的表达 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 Ad-rhLTF 对小鼠胸腺指数、脾指数的影响 |
| 4.5.2 Ad-rhLTF 对 EMT6 乳腺癌小鼠非特异性免疫功能的影响 |
| 4.5.3 Ad-rhLTF 对荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响 |
| 4.5.4 Ad-rhLTF 对细胞因子 IL-2 和 TNF-α的影响 |
| 4.5.5 Ad-rhLTF 对 PBMC 协同刺激分子 B7 表达的影响 |
| 4.5.6 小鼠脾细胞中 NF-κB 和 AP-1 的表达 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 Ad-rhLTF 诱导人 MCF-7 乳腺癌细胞凋亡的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 试剂配制 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 细胞培养和收集 |
| 5.3.2 MTT 法检测 MCF-7 细胞增殖活性 |
| 5.3.3 Ad-rhLTF 的转染程序 |
| 5.3.4 Ad-rhLTF 转染 MCF-7 细胞后 hLTF 的表达 |
| 5.3.5 苏木精-伊红染色试验 |
| 5.3.6 Hoechst 33342 荧光单染试验 |
| 5.3.7 AO/EB 荧光双染试验 |
| 5.3.8 电镜观察 MCF-7 细胞的凋亡 |
| 5.3.9 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位 |
| 5.3.10 Annexin V- FITC 染色检测 MCF-7 细胞凋亡 |
| 5.3.11 凝胶电泳法 MCF-7 细胞 DNA ladder 分析 |
| 5.3.12 MCF-7 细胞的 TUNEL 染色 |
| 5.3.13 Ad-rhLTF 对 MCF-7 细胞周期的影响 |
| 5.3.14 Bcl-2 和 Bax mRNA 表达水平的检测 |
| 5.3.15 数据处理 |
| 5.4 试验结果 |
| 5.4.1 Ad-rhLTF 对 MCF-7 细胞增殖的影响 |
| 5.4.2 Ad-rhLTF 转染 MCF-7 细胞后 hLTF 表达结果 |
| 5.4.3 Ad-rhLTF 处理后 MCF-7 细胞形态学特征 |
| 5.4.4 Hoechst 33342 荧光单染法检测 MCF-7 细胞凋亡 |
| 5.4.5 AO/EB 荧光双染观察 MCF-7 细胞凋亡 |
| 5.4.6 电镜观察 MCF-7 细胞凋亡 |
| 5.4.7 Ad-rhLTF 影响 MCF-7 细胞线粒体膜电位的结果 |
| 5.4.8 MCF-7 细胞经 AnnexinV-FITC 染色后流式细胞仪检测结果 |
| 5.4.9 MCF-7 细胞 DNA 片段化分析结果 |
| 5.4.10 MCF-7 细胞的 TUNEL 染色结果 |
| 5.4.11 MCF-7 细胞周期检测结果 |
| 5.4.12 细胞凋亡相关基因 Bcl-2 和 Bax 的 mRNA 表达 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 Ad-rhLTF 转染 MCF-7 细胞的评价 |
| 5.5.2 Ad-rhLTF 对 MCF-7 细胞增殖能力的影响 |
| 5.5.3 Ad-rhLTF 诱导 MCF-7 细胞凋亡形态学变化 |
| 5.5.4 Ad-rhLTF 对线粒体膜电位的影响 |
| 5.5.5 AnnexinV-FITC 凋亡检测结果评价 |
| 5.5.6 DNA 片段化结果分析 |
| 5.5.7 TUNEL 染色结果的评价 |
| 5.5.8 Ad-rhLTF 对 MCF-7 细胞周期的影响 |
| 5.5.9 Ad-rhLTF 诱导 MCF-7 细胞凋亡的分子机制 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）乳腺癌相关基因表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 1 原癌基因和抑癌基因 |
| 1.1 原癌基因 |
| 1.1.1 HER-2基因 |
| 1.1.2 C-myc基因 |
| 1.1.3 AKT2 |
| 1.1.4 Int-2基因 |
| 1.2 抑癌基因 |
| 1.2.1 p53基因 |
| 1.2.2 p16、p21WAF1基因 |
| 1.2.3 nm23基因 |
| 2 增殖与凋亡相关标志物 |
| 2.1 PCNA |
| 2.2 Ki67 |
| 2.3 MCM7 |
| 2.4 cyclinD1基因 |
| 3 与侵袭和转移相关的因子 |
| 3.1 细胞粘附分子CD44 |
| 3.2 血管生成因子VEGF |
| 3.3 Cath-D |
| 4 激素受体 |
| 5 特异性蛋白 |
| 5.1 端粒酶 |
| 5.2 PS2 |
四、乳腺癌中P21基因产物的表达及其临床意义（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA lnc-Z38对胃癌发生发展的调控作用和相关机制研究[D]. 王阳. 山东大学, 2019(02)
- [2]MYC在乳腺癌组织中的表达及其对p53缺失的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响[D]. 姜丹丹. 青岛大学, 2019(07)
- [3]FOXP3与Galectin-1的相互作用拮抗FOXP3抑癌功能及机制研究[D]. 李晓菊. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [4]SET7/9介导E2F1甲基化途径调控肝细胞癌恶性表型及相关机制的研究[D]. 顾页. 东南大学, 2019(01)
- [5]人类新基因AC3-33可变剪接体的鉴别和功能分析[D]. 袁陆. 华北理工大学, 2017(06)
- [6]Ezrin和P21在乳腺癌中的表达及临床意义[D]. 王晓娇. 南昌大学, 2015(04)
- [7]基础研究与临床应用——浙江省肿瘤医院科研发展历程[J]. 许沈华,毛伟敏,葛明华,高永良,凌志强,林能明,高赟. 中国肿瘤, 2013(12)
- [8]生物钟基因Npas2在乳腺癌发生中的作用及刺五加黄酮对生物钟基因表达的影响和抗肿瘤机制[D]. 李新白. 吉林大学, 2012(12)
- [9]重组人乳铁蛋白抗乳腺癌作用及其机制研究[D]. 王建杰. 燕山大学, 2012(10)
- [10]乳腺癌相关基因表达及其临床意义[J]. 陈亚民,宋蔚青. 中国现代医药杂志, 2011(04)