一、利用YADE法进行棉花基因组PCR步行（论文文献综述）
陈君[1]（2011）在《矮牵牛PMADS9基因的启动子克隆与功能分析》文中研究表明MADS-box基因是一类广泛存在于植物中的同源异型基因,在生物体不同的组织以及生长发育的不同阶段都存在MADS-box基因的表达,它属于一个古老的基因家族,是植物生长发育过程中重要的调控因子。目前对MADS-box基因调控机理的研究已成为植物分子生物学领域中的一大热点。矮牵牛PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族的成员,该亚家族基因可能具有调控开花时间、抑制花器官衰老脱落和促进体胚形成等功能。通过RACR技术和YADE法,我们分别从矮牵牛小花蕾RNA和叶片DNA基因组中克隆得到了PMADS9基因的编码区（GenBank登录号：DQ418547）和5’端翻译起始位点（ATG）上游1053bp的启动子序列（GenBank登录号：FJ798977）。然后在两端设计引物,利用PCR技术从基因组DNA中扩增得到了全长基因序列共5861bp（GenBank登录号为EU338501）。RACE分析发现该基因至少有4个转录起始位点（TSS）,2个位于编码区第一外显子内。本研究,继续克隆了PMADS9基因上游未知的启动子区域,获得了更长的800bp序列,并对该启动子的功能进行了初步地研究,这对于进一步了解PMADS9基因表达调控的特点,以及更深入研究矮牵牛花器官发育的分子机理都有着重要的意义。本文所取得的主要实验结论如下：1.在已获1053bp启动子序列的基础上,利用hiTAIL-PCR技术对矮牵牛PMADS9基因上游未知启动子序列进行了再扩增,获得了更长的800bp启动子片段,用SeqMan软件对新获取的序列与原有1053bp序列进行了拼接,最终获得了PMADS9基因全长启动子序列1853bp。2.运用PLACE和PlantCare等在线分析软件对该序列进行了预测分析,该启动子除了具有TATA-box和CAAT-box等基本转录元件外,还富含花粉和种子发育过程中特异表达所需的调控元件,以及与环境应答相关的各种顺式调控元件。FootPrinter分析表明,AGL15同源基因启动子之间存在非常保守的RY-repeat元件,启动子的保守性与物种的遗传距离不一致；推测PMADS9基因翻译起始位点（ATG）上游200～400bp和800～1000bp区域具有重要的功能。3.应用PCR技术对启动子序列进行5’缺失；用各缺失片段替换表达载体pCAMBIA1305.1中的CaMV35S组成型启动子序列,与GUS报告基因连接,成功构建了所有缺失重组表达载pCAMBIA1305.1空载为阳性对照,转化矮牵牛V1。GUS染色与PCR鉴定表明,成功实现了各表达载体对矮牵牛的稳定遗传转化,获得了阳性转基因植株。4.待移栽后的转基因植株开花后,对其进行GUS组织化学染色分析,结果表明全长启动子序列（1853bp）转化后的阳性植株,在茎、营养叶、苞叶以及花萼中几乎检测不到GUS活性；GUS基因在雄蕊、雌蕊、子房中有较高的表达丰度,在花瓣中也有一定丰度的表达,这与之前PMADS9基因表达分析的结果基本一致。在转基因植株内,各缺失表达载体的表达模式无明显差异,最短的启动子缺失片段（298bp）就能启动报告基因在转基因植物体内表达,说明其已具备启动子所需的各种基本调控元件。
郭余龙,闫明旭,陈君,马婧,李名扬[2]（2011）在《矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及分析》文中研究指明矮牵牛PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族的成员。该亚家族基因可能具有调控开花时间、抑制花器官衰老脱落和促进体胚形成等功能。本文应用YADE和hiTAIL-PCR等方法,克隆了PMADS9基因5′端翻译起始位点上游1853bp的启动子区域序列（FJ798977）;RACE分析发现该基因至少有4个转录起始位点,2个位于编码区第一外显子内。启动子调控元件分析显示,PMADS9启动子富集花粉和种子发育过程中特异表达元件和与环境应答相关的元件;AGL15同源基因启动子存在非常保守的RY-repeat元件,启动子的保守性与物种的遗传距离不一致;推测PMADS9启动子翻译起始位点上游200～400bp和800～1000bp区域具重要功能。
王学仁[3]（2010）在《担子菌毛头鬼伞的TMV抗性蛋白y3基因的分离、鉴定和表达》文中认为许多具有生物活性的蛋白质具有潜在的应用价值,因而吸引着人们的研究兴趣。目前已被纯化和鉴定的真菌蛋白质有：核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、类-泛素蛋白、免疫调节蛋白、漆酶、凝集素、抗病毒蛋白,以及其他酶类：纤维素酶木聚糖酶、转化酶、核糖核酸酶等。对毛头鬼伞（Coprinus comatus （Mull.:Fr.） S. F. Gray）生物活性蛋白研究较深入的当属毛头鬼伞抗性蛋白Y3。该蛋白具有抗植物病毒TMV的活性、红细胞凝集活性,也与核糖体失活蛋白（RIP）有所相似。抗性蛋白Y3作为一种新的蛋白资源,有希望开发成转基因的抗病毒工程产品用于生物农药生产。为了达到此目的,首先需要获得抗蛋白基因y3的全长序列,并鉴定该基因抗病毒特性。鉴于毛头鬼伞的抗性蛋白Y3具有潜在的应用价值和开发前景,本文分离了抗性蛋白y3基因,并分析了它的结构与功能。取得的主要结果如下：（1）用YADE法从毛头鬼伞菌丝体中分离了抗性蛋白基因y3的全长DNA序列,发现其由1289 bp核苷酸组成（GenBank Accession No. HM204931）,包括5L侧翼和3L侧翼区。（2）用5’-RACE从毛头鬼伞菌丝体中克隆出y3基因的全长cDNA序列,该全长序列由534个bp组成,含1个ORF,编码130个氨基酸残基。GenBank和EMBL中索引号（Accession No.）分别为GQ859168和FN546262。（3）y3基因的DNA和cDNA比对表明, y3基因含5个外显子和4个内含子。本研究获得的抗性蛋白基因y3的全长序列与前人报道的研究结果之间,有101个氨基酸残基共享序列。全长序列推导的氨基酸序列比原先增加了29个氨基酸残基。依据本研究的实验数据,使用在线网络启动子预测系统,发现了抗性蛋白基因y3的转录起始位点A和TATA盒,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。（4）本研究得到的cDNA全长序列和由此推导的氨基酸序列与前人发表的基因y3的部分对应片断都表现出了高度的相似性,相似率达94%。利用y3基因全长序列信息,克隆了y3基因cDNA序列,并用它与pBI121和pCAMBIA1301构建了植物表达载体pCAMBIA1301-y3。（5）用pCAMBIA1301-y3转化烟草,获得了转基因植株。经PCR, RT-PCR和Northern blot分析证实,y3基因已经整合到烟草基因组中,并在其中得到表达。对TMV的抗性鉴定也表明,y3基因导入使转基因烟草植株表现出一定抗病毒活性。y3基因全长序列的获得和对烟草的成功转化为y3基因的进一步研究奠定了基础。（6）对前人关于真菌核酸的快速提取方法做了改进,用于真菌和烟草DNA和RNA的提取。同时,通过低温保藏试验评价核酸提取液和提取产物的稳定性和有效性；利用凝胶电泳、PCR和RT-PCR等方法比较分析核酸质量；并将提取效果与传统方法或试剂盒的提取效果进行比较。结果表明,改进后的提取方法是一种简单、方便和有效的实验方法,不仅可用于真菌也可用于植物DNA和RNA提取,用这种方法提取得到的DNA和RNA在低温保存条件下比较稳定,能较长时间保持其原有活性。（7）在从毛头鬼伞中克隆抗性蛋白基因y3时意外获得的一条非目的条带,长度为906 bp （GenBank Accession No. GU568178）。将此序列通过NCBI的BLAST搜索,以及与其同源序列进行Clustal w和MEGA4.1聚类分析,证实该序列是28S rRNA。同时还发现毛头鬼伞的系统进化关系比较离散。此外,在这一新28S rRNA与TMV的抗性蛋白基因y3之间发现有两个同源区段有可能是PCR扩增y3基因时出现非目的条带的原因。在这两个同源区段中,其一与克隆y3基因时所用的PCR引物之一有较高的相似性,另一区段也是一般PCR引物的类似物。本研究中新28S rRNA序列的获得是PCR扩增中出现非目的条带的新例,这一新序列的发现及聚类分析的结果有助于该真菌基因组学及真菌生物分子分类系统的建立。
罗志兵,金凯,张永军,武增强,裴炎[4]（2010）在《球孢白僵菌高渗适应性相关基因Bbmpd的克隆与表达分析》文中研究指明【目的】克隆与球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的高渗适应性相关基因,并对其功能进行分析,以揭示球孢白僵菌对高渗等逆境适应的分子机理。【方法】利用YADE法克隆T-DNA的侧翼序列并进行基因组步行,获得突变基因的全长及上游序列;利用RT-PCR技术分析突变基因的表达特性以及与Bbhog1的关系;采用同源重组技术敲除Bbmpd基因。【结果】克隆得到插入突变基因及其上、下游序列全长3037bp。该基因与编码球孢白僵菌的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因相似性为98%。Bbmpd的表达受高渗环境（0.8mol/L NaCl）的诱导,受Bbhog1信号途径的激活调节,Bbhog1缺失导致Bbmpd表达下调。Bbmpd缺失突变体在高渗胁迫下的生长受到明显抑制。Bbmpd缺失不影响球孢白僵菌在查氏培养基上的生长和产孢。【结论】由T-DNA突变体克隆了编码球孢白僵菌1-磷酸甘露醇脱氢酶基因Bbmpd,该基因的表达受高渗环境的诱导和Bbhog1的调控,与球孢白僵菌高渗适应性相关。
曹华雯[5]（2010）在《甘菊BADH基因启动子功能鉴定及诱导型启动子的分离》文中认为菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）是我国传统十大名花和世界四大鲜切花之一,近年来利用植物基因工程技术培育菊花新品种已经成为研究热点,并取得了初步成果。目前在菊花转基因研究中主要使用花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子,该启动子为组成型表达启动子,在转基因植株的各个器官和生长发育的所有时期均表达,容易打破转基因植株的代谢平衡,对其正常生长发育造成影响,有时在转基因植株中还易引起外源基因的沉默。诱导型启动子可以利用外界物理或化学条件的变化启动其表达活性,在非诱导条件下其在转基因植株中表达水平较低,对受体植株的伤害较小,因此利用诱导型启动子进行菊花转基因工程研究,具有重要的理论和实践意义。甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase, BADH）基因是甜菜碱合成途径中的重要基因,植物中研究表明该基因的表达受干旱、盐、ABA和低温等的胁迫诱导。本课题组前期已经从菊科菊属植物甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium （Fisch. ex Trautv.） Makino]中克隆得到了4个BADH基因启动子序列DBP11、DBP12、DBP21和DBP22 （GenBank登录号分别为DQ497620-23）,并利用瞬时表达分析证明4个序列均具有启动GUS报告基因的功能。本研究在此基础上利用转基因的方法研究4个启动子的胁迫诱导活性,并选取其中表达活性较高的启动子进行缺失试验,研究其上顺式作用元件的功能。本研究主要取得如下成果：1.利用实时荧光定量PCR和雷氏盐紫外分光光度计法分别测定了400mmol／LNaCl胁迫处理0h、0.5h、2h、12h、1d、2d、4d、6d、8d、10d和12d,20%PEG-6000胁迫处理0h、0.5h、2h、12h、1d、2d、6d,甘菊叶片中BADH基因表达量和甜菜碱含量的变化。试验结果表明：在高盐胁迫下甘菊叶片中BADH基因表达量和甜菜碱含量均呈现先上升后下降的趋势。在处理初期（0.5h和2h）BADH基因的表达量与对照相比略有下降,此后随处理时间的增加BADH基因表达持续增大,在胁迫处理6d时BADH基因表达量最大为对照的4.6倍,此后BADH基因表达量逐渐降低。甜菜碱含量在NaCl处理0.5h明显增加,此后其含量出现了小幅的震荡上升,在胁迫处理4d时达到了最大值,之后随胁迫处理时间的增加甜菜碱含量逐渐降低。二者之间的变化并不是同步的,而是存在滞后性,分析认为甘菊叶片中BADH基因表达与甜菜碱积累间存在相互抑制的作用。甘菊BADH基因在20%PEG-6000胁迫处理0.5h表达量明显增大,之后活性降低,在胁迫处理1d时表达量达到最大值。2.将甘菊BADH基因启动子DBP11、DBP12、DBP21和DBP22与GUSplus报告基因融合构建植物表达载体,转化烟草。对转基因植株进行NaCl、干旱、ABA、SA和低温胁迫处理,通过测定GUS活性鉴定启动子的诱导性。结果表明：DBP11、DBP12和DBP21启动子均响应NaCl、干旱、ABA和低温胁迫处理,其中DBP12启动子诱导活性更强,DBP22启动子只响应NaCl和低温胁迫处理,且其基本活性仅为DBP11、DBP12和DBP21的0.1倍。3.选取诱导活性较强的DBP12启动子,根据其上顺式作用元件的分布位置设计不同的引物,利用PCR的方法对DBP12启动子进行5’和3’端缺失,将7个缺失片段与GUSplus报告基因融合构建植物表达载体。用农杆菌介导的叶盘转化法转化甘菊叶片,瞬时表达的结果表明,7个载体构建成功。4.将7个DBP12启动子的缺失片段转化烟草,对转基因植株进行NaCl、干旱、ABA和低温胁迫处理,利用GUS活性变化检测启动子各片段的表达差异。DBP12启动子上同时含有抑制子和增强子；在DBP12启动子上响应NaCl、干旱、ABA和低温胁迫诱导的顺式作用元件为MYB、MYC识别位点和ACACNNG core;同时DBP12启动子上所含有的抑制子也和顺式元件一起共同作用调控BADH基因对胁迫信号的响应；此外BADH基因对于启动子基础活性及响应干旱、NaCl、ABA和低温诱导具有重要作用,5’-UTR对于BADH基因响应低温胁迫诱导的作用是唯一的。5.利用接头染色体步移法,以甘菊盐胁迫条件下表达的6条EST序列为基础,从甘菊Genome Walker库中克隆得到了其中4条片段上游DNA序列,经启动子软件分析结果显示,片段24.1（ADP核糖焦磷酸水解酶基因）上含有与水分和生物胁迫相关的顺式作用元件。利用双酶切的方法将克隆得到的24.1启动子片段替换载体pBI121上的35S启动子,将新构建的植物表达载体转入农杆菌中,并用叶盘法侵染甘菊和菊花叶片,进行瞬时表达研究。试验结果表明,所克隆的24.1的启动子片段具有驱动下游报告基因表达的功能。本研究鉴定了甘菊BADH基因启动子响应干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导的顺式作用元件的种类和分布的位置。为菊花转基因工程中诱导型启动子的应用奠定了基础。
杨晓娜,赵昶灵,李云,李会容,苏丽,周燕琼[6]（2010）在《启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展》文中研究指明综述了启动子序列克隆和功能研究方法的研究进展。启动子克隆的主要方法有基因组文库筛选法、探针载体筛选法、常规PCR法、反向PCR法、锅柄PCR法、序列特异性引物PCR法、热不对称交错PCR法和Y型接头扩增法。其中,热不对称交错PCR法因操作简便、特异性较高而最有效。启动子功能分析方法有生物信息学分析法和实验分析法,前者主要依托数据库初步预测启动子序列;后者确定启动子的顺式元件及其功能,具体策略有点突变分析、凝胶阻滞分析、瞬间表达分析、转化分析和酵母单杂交分析。可为启动子功能的研究提供参考。
闫明旭[7]（2009）在《矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及功能分析》文中指出MADS是由几个最初发现的成员酵母MCM1、拟南芥AGAMOUS、金鱼草DIFICIENS和人类SRF的首字母组合而来。MADS-box基因是指含有保守的DNA结合域MADS盒的转录调控因子,该基因是一类同源异型基因,属于一个古老的基因家族,是重要的转录调控因子,在发育调控和信号传导等生命活动中发挥重要作用。分离并研究MADS-box基因,将有助于探明植物生殖发育的分子模式,并为观赏植物和花卉品种的基因工程改良奠定基础。PMADS9是最近在观赏花卉矮牵牛中发现的AGL15亚家族基因,他们共同归属于MADS-box基因家族,其功能尚未见报道。目前我们已经从矮牵牛幼蕾cDNA中克隆出PMADS9基因（GenBank登录号:DQ418547）编码区域,构建了植物表达载体,并利用农杆菌介导法将PMADS9基因导入矮牵牛,获得了转基因株系。在此基础上利用PCR技术扩增获得该基因7个内含子,最终获得PMADS9基因全长5861bp,GenBank登录序列号为EU338501。目前,我们对PMADS9基因进行了初步验证和分析,取得了一定的成果。但是经过农杆菌介导转化矮牵牛后,与我们的预期目的有一定的差距,经过多方面的分析,为了更加充分的对PMADS9基因进行研究,我们继续克隆其基因上游的启动子区域。我们认为对PMADS9基因启动子的功能进行分析有助于进一步分析和了解PMADS9基因,进一步确认AGL15亚家族基因的功能,并揭示其在植物种之间功能表现的差异。本试验利用多模板Y形接头延伸法（Y-shaped adaptor dependent extension）进行PMADS9基因相邻启动子序列的连续扩增,简称YADE法扩增。YADE法是一种扩增已知DNA片段相邻序列的方法,但其效率常受到已知序列周围酶切位点数目的限制。在Y形接头延伸中采用由多种酶切和连接产生的DNA作模板,大大提高了该方法扩增相邻序列的效率,实现了相邻序列的连续扩增。提取矮牵牛叶片DNA并纯化,然后选用7种限制性内切酶酶切纯化的DNA,用作PCR模板,克隆出矮牵牛PMADS9基因上游启动子序列1053bp,GenBank登录号为FJ798977,通过在线比对分析发现,该序列既具有启动子的一般结构特征又具有其自身特性。如TATA-BOX、CAAT-BOX、ACGTA-BOX等都是启动子的一般保守性调控元件;G-BOX与光调控相关的元件、Skn-1-motif胚乳特异表达必须顺式作用元件、TCA水杨酸应答元件等是矮牵牛PMADS9基因启动子所特有的顺式作用元件。又进一步构建克隆载体pMD-prom、瞬时表达载体pMD-prom-Gus和表达载体pCAMBIA1381Z-prom,通过基因枪转化,初步发现该序列有启动活性。
陆亚敏[8]（2008）在《棉花GaMYB7和GbGLU基因启动子的克隆和初步功能验证》文中提出棉花是第一大天然纤维产物,在世界纺织工业中具有重要的经济地位。随着人们生活水平的提高和纺织技术的进步,也对棉纤维品质提出了更高的要求。而阐明纤维发育的细胞和分子机理,发现改良棉纤维的靶基因,是改良纤维品质的基础。研究这些棉花纤维特异基因的启动子既有助于进一步明确该基因的功能,也为基因工程的研究打下了基础。棉花黄萎病（Verticillium spp）是棉花生长过程中最具破坏力的病害之一,在世界范围内流行。在我国,棉花黄萎病是棉花生产的主要障碍之一。使用棉花黄萎病病原诱导的启动子来介导抗病基因的表达,不仅会获得目的产物、达到预定目标,而且也不会产生副作用。植物抗病相关启动子的调控特性研究、分离及其应用对于提高植物抗病性极其关键。本研究选取了两个目标基因,棉花花和纤维特异表达基因GaMYB7和棉花黄萎病诱导表达基因GbGLU,克隆了这两个基因的启动子序列,具体工作如下:（1）通过筛选江陵中棉BAC文库的方法,得到了含有GaMYB7基因的阳性单克隆,以此作为TAIL-PCR的起始模板,获得的总长度1566bp的GaMYB7基因上游序列。经过序列分析确定了转录起始位点（TSS）、TATA box和CAATbox。通过序列分析发现,该序列包含多个光调控元件,还具有生长素和赤霉素应答的基本结构。在此基础上,构建了3个5’端启动子片段驱动GUS基因的植物表达载体。通过基因枪转化棉花胚珠瞬时表达实验发现,三个启动子片段均能指导报告基因在棉花胚珠中正常表达。TM-1棉花0DPA胚珠离体诱导实验表明,GaMYB7基因的表达受GA3和IAA浓度的影响,10uMIAA时,GaMYB7基因的表达量最高;但是过高浓度的GA3会抑制GaMYB7基因的表达。在20001x的光照强度下诱导处理棉花胚珠发现,与暗处理相比,早期（10天之前）光照处理可以有效提高GaMYB7基因的表达量;后期（10天之后）反而会抑制GaMYB7基因的表达。因此,GaMYB7启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。（2）通过筛选陆地棉遗传标准系TM-1 BAC文库,得到了GbGLU基因的阳性单克隆,以此作为TAIL-PCR的起始模板,分离了GbGLU基因5’侧翼序列,总长度为1357bp。PLACE分析表明,该序列含有TATA box和CAAT box,还有病原菌诱发子反应元件W-box、GT-1、MYB、MYBST1等。将GbGLU基因5’侧翼序列以不同的缺失与GUS基因融合构建了3个植物表达载体。通过农杆菌介导转化棉花胚性愈伤发现,三个启动子片段均能指导报告基因在棉花愈伤中表达。GbGLU启动子能否用于棉花抗黄萎病的转基因研究还需进一步实验证明。
刘灏[9]（2008）在《棉花基因GhHOX2启动子的克隆与功能分析》文中指出我国是世界上最大的棉花生产国和消费国。棉花生产在我国国民经济中有着非常重要的地位。棉花纤维细胞是由胚珠外表皮细胞分化而成,其整个发育过程中都是以单细胞形式存在。在表皮细胞突起后,纤维细胞迅速伸长,可以将细胞的分化与细胞的伸长发育过程完全分开。随着纤维细胞生长发育的进行,细胞形态变化越来越大,最后其长/径比可达1,000-3,000。棉纤维分化、发育过程表现出的这些特点使之成为研究植物细胞分化、伸长及纤维素生物合成的理想材料。纤维细胞的分化发育是一个非常复杂的过程,在这个过程中,转录因子对基因的表达调控起着十分重要的作用。但目前对于转录因子调控棉花纤维分化发育的研究还处于初步阶段,仅有少数转录因子基因得到克隆。GhHOX2是从发育中的棉花纤维细胞中克隆的一个Homeobox（同源异型盒）基因,为了研究GhHOX2基因启动子功能,本研究通过改良的YADE法从陆地棉基因组中克隆了GhHOX2的5′上游启动子序列,将所克隆的启动子与GUS基因融合构建表达载体,通过遗传转化手段将其转入烟草,分析了启动子的功能,获得的主要结果如下:1.GhHOX2基因的基因组结构分析和表达分析Southern杂交分析表明,GhHOX2基因为多拷贝基因,在陆地棉基因组中有两个子拷贝。通过RT-PCR检测GhHOX2基因表达情况,发现其在陆地棉的根、茎、真叶、子叶、花蕾、花冠、9d纤维和胚珠中均有表达,为组成性表达的转录因子基因。Real-time PCR对GhHOX2基因表达定量分析结果表明:GhHOX2基因在各组织器官中的表达量有差异,在陆地棉的子叶和花冠的相对表达量最高,而在根、花蕾和纤维中的相对表达量较低。2.GhHOX2基因启动子序列的克隆获得了GhHOX2基因的基因组序列,全长4.29kb,其中含有10个内含子、11个外显子,有两个HindⅢ位点。根据基因组序列设计引物,采用改良的YADE方法进行启动子克隆,得到了GhHOX2基因5′上游1218bp序列。根据拼接序列设计引物,从陆地棉基因组中扩增出GhHOX2基因两个不同的启动子,命名为pHOX2-1和pHOX2-2,分别为1218bp和1195bp。序列分析表明,pHOX2-1与pHOX2-2有85%的序列完全相同,不同的部分主要出现在-1140～-483位置。其中pHOX2-1内部有一个HindⅢ位点,而pHOX2-2则有两个。对启动子与部分基因编码区序列（包括一个外显子和一个内含子）进行扩增,得到了两个不同的克隆,测序结果表明分别为pHOX2-1和pHOX2-2与相同的编码区序列,证明了两个启动子同为GhHOX2基因的启动子。后通过对雷蒙德氏棉、非洲棉和亚洲棉HOX2基因的启动子分析,结果表明pHOX2-1可能来源于雷蒙德氏棉的D5染色体组,pHOX2-2可能来源于非洲棉的A1染色体组。3.GhHOX2基因启动子在转基因烟草中的功能分析为了研究GhHOX2基因启动子的功能,构建了启动子与GUS基因融合构建表达载体,通过遗传转化手段将其转入烟草中。转基因烟草的GUS化学组织染色结果表明,pHOX2-2启动子在烟草的茎、花托和开花当天的子房有表达外,在萼片中也有微弱表达。而pHOX2-1启动子仅在烟草的花托和开花当天的子房有表达。转基因烟草的GUS荧光酶活定量分析表明,pHOX2-2在子房中的GUS酶活最高,达到3445.81pmol/mg/min,但仅为CaMV35S启动的GUS酶活的3%;花托中的GUS酶活达到3192.98pmol/mg/min,为CaMV35S启动的GUS酶活的2.2%;茎中的GUS酶活达到2178.36 pmol/mg/min,为CaMV35S启动的GUS酶活的1%。pHOX2-1在子房中的GUS酶活最高,达到875.61pmol/mg/min,只有pHOX2-2启动活性的25%,CaMV35S启动活性的0.77%:在花托中的启动活性达到501.63 pmol/mg/min,为pHOX2-2启动活性的15.7%,CaMV35S启动活性的0.38%。结果暗示,pHOX2-1与pHOX2-2由于在序列结构上有15%的碱基不同,可能造成了二者在烟草中的启动部位和启动活性存在比较大的差异。
罗凤涛[10]（2008）在《五个异源启动子在烟草与棉花中的表达特性研究》文中研究说明棉花是世界上重要的纤维作物,在世界经济中占有重要地位。棉纤维的产量和品质直接决定了棉花生产的产值和效益,利用基因工程手段来增加产量和改良品质是一种高效的途径,而有效的胚珠和纤维特异表达启动子是实现这一目标的关键部分。到目前为止,已获得的特异启动子数量非常有限,为找寻更多有效的纤维和胚珠特异表达启动子,本论文根据前人的研究选取了五个来源于拟南芥、烟草、菜豆的种子特异表达启动子,分别是BAN（BANYULS gene promoter）、AAP1（Amino acid permease gene 1 promoter）、AAP2（Amino acid permease gene 2promoter）、NtSC（Tobacco seed coat cryptic promoter）和PV（Seed storage proteingene arcelin 5-Ⅰpromoter）,将其与GUS报告基因连接并构建了植物表达载体,然后分别导入烟草（Nicotiana tabacum,Xanthin）和棉花冀棉14（Gossypium hirsutum,Jimianl4）,并用组织化学染色方法分析了它们的表达特性。主要结果如下:1.五个启动子在烟草中的表达特性转基因烟草的GUS染色分析表明,BAN和NtSC启动子驱动GUS基因特异地在烟草珠被（种皮）中强烈表达,而在种皮以外的器官或组织如种胚、花药、根、茎、叶、幼苗等未检测到GUS活性。从表达时期上看,在-2dpa（dayspost-anthesis）花蕾的胚珠中就开始有BAN启动子表达,直到种子发育成熟都一直检测到了GUS活性。NtSC启动子则在开花后的胚珠中表达,其表达持续至种子成熟。在烟草中,AAP1启动子在种皮和胚中特异表达,其它器官和组织没有检测到GUS活性。AAP1启动子在胚发育的早期即开始表达,随着胚的发育,表达强度逐渐减弱,到种子成熟时则检测不到GUS基因表达。PV启动子也特异地在烟草种子中表达,与AAP1启动子不同,PV仅在胚中表达而在种皮中没有GUS活性。从表达时期上看,PV启动子在种胚发育的各时期都有表达,并且表达强度高。在种子萌发而成的幼苗的子叶、胚轴、胚根中也检测到了GUS活性。AAP2启动子在烟草的根、茎的维管束和叶脉中都有表达,在胚珠中有微弱的GUS基因表达。这些结果表明,AAP2在烟草中是维管组织特异表达的启动子。2.四个特异启动子在棉花中的表达特性根据以上五个特异启动子在烟草中的表达特性,我们选取BAN、AAP2、AAP1和NtSC四个在种皮里有表达活性的启动子来进行棉花遗传转化,以研究它们在棉花中的表达模式。转基因棉花的GUS染色分析结果表明,BAN启动子主要在棉花胚珠、种皮、纤维、根的内皮层、茎的木质部和叶柄中表达。在-1dpa的胚珠中检测到GUS活性,表达持续到种子成熟,4～5dpa是表达最强时期。1dpa胚珠染色后切片观察表明,表达部位限定在种子的表皮及突起的纤维细胞中。在AAP1::GUS和NtSC::GUS转基因棉花中,GUS基因的表达组织部位相同,均特异地在种子胚中表达。从表达时期看,AAP1和NtSC启动子都在子叶胚时期开始表达,表达持续到种子成熟,在种子萌发后仍然能检测到GUS活性。从表达强度看,AAP1启动子开始表达时较强,随后逐渐减弱;NtSC启动子开始表达时较弱,种子成熟时表达较强。AAP2启动子在棉花的根和胚乳中特异表达。20dpa的棉花种子中,胚囊里的胚乳组织有GUS蓝色染出,随着胚的成熟染色越来越深,种子成熟时,在紧裹胚的胚乳遗迹上仍有强烈的GUS表达。在根中,GUS仅在维管组织的韧皮部中表达,其它部位未检测到GUS活性。本论文研究结果表明,PV、AAP1、AAP2和NtSC启动子在不同植物中表达特异性相似,BAN在棉花中的表达特性与烟草不同。这几个启动子在棉花中的表达均具有特异性,根据它们在棉花中的表达特性,这些研究结果可为这5个启动子在植物基因工程中的应用奠定基础,也为棉花基因工程研究提供了特异启动子。
二、利用YADE法进行棉花基因组PCR步行（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用YADE法进行棉花基因组PCR步行（论文提纲范文）
（1）矮牵牛PMADS9基因的启动子克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物花器官发育的模型 |
| 1.1.1 植物花发育经典ABC模型 |
| 1.1.2.ABC模型的发展 |
| 1.2 植物MADS-BOX基因与AG亚家族基因 |
| 1.2.1.MADS-box基因 |
| 1.2.2.AG亚家族基因 |
| 1.3.植物启动子研究进展 |
| 1.3.1.启动子的结构特征 |
| 1.3.2.启动子类型及特点 |
| 1.3.3.植物基因启动子克隆方法 |
| 1.3.4.启动子研究方法 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 实验材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和载体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要设备 |
| 3.1.5 常用试剂配制 |
| 3.1.6 基本培养基配 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 矮牵牛DNA的提取和纯化(CTAB法) |
| 3.2.2 hiTAIL-PCR法扩增PMADS9基因上游启动子序列 |
| 3.2.3 对拼接获得的PMADS9基因上游启动子序列进行全长克隆 |
| 3.2.4 对启动子序列进行生物信息学分析 |
| 3.2.5 启动子5'端缺失表达载体构建 |
| 3.2.6 农杆菌介导转化矮牵牛 |
| 3.2.7 阳性转基因再生植株鉴定 |
| 3.2.8 阳性转基因再生植株各组织GUS活性检测 |
| 第4章 实验结果与分析 |
| 4.1 矮牵牛PMADS9基因启动子序列克隆 |
| 4.1.1 矮牵牛基因组DNA提取和纯化 |
| 4.1.2 hiTAIL-PCR法扩增得到更长启动子序列 |
| 4.1.3 全长启动子序列克隆 |
| 4.2 矮牵牛PMADS9基因启动子序列生物信息学分析 |
| 4.2.1 启动子序列上游调控元件预测与分析 |
| 4.2.2 AGL15直向同源基因启动子比较分析 |
| 4.3 启动子5'端缺失系列表达载体构建 |
| 4.3.1 缺失片段获得 |
| 4.3.2 表达载体构建 |
| 4.4 转基因矮牵牛阳性植株的筛选与鉴定 |
| 4.4.1 GUS染色鉴定 |
| 4.4.2 PCR鉴定 |
| 4.5 各缺失启动子在转基因植物中表达模式鉴定 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 HITAIL-PCR在克隆侧翼未知序列中的应用 |
| 6.2 利用多个软件对同一个启动子序列进行预测分析 |
| 6.3 矮牵牛稳定遗传转化 |
| 6.4 后续研究 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 附录 |
| A:攻读硕士学位期间发表的论文目录 |
| B:攻读硕士学位期间参加的科研项目 |
（2）矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 PMADS9启动子序列克隆及鉴定 |
| 1.2 PMADS9转录起始位点的鉴定 |
| 1.3 PMADS9启动子转录元件分析 |
| 1.4 AGL15 直向同源基因启动子序列的获取及系统发育足迹分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 序列克隆 |
| 2.2 PMADS9转录起始位点分析 |
| 2.3 PMADS9启动子上游调控元件分析 |
| 2.4 AGL15直向同源基因启动子分析 |
| 3 讨论 |
（3）担子菌毛头鬼伞的TMV抗性蛋白y3基因的分离、鉴定和表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 真菌资源生物活性蛋白质的研究 |
| 1.1.1 核糖体失活蛋白 |
| 1.1.2 抗真菌蛋白质 |
| 1.1.3 类-泛素蛋白质 |
| 1.1.4 免疫调节蛋白 |
| 1.1.5 漆酶 |
| 1.1.6 凝集素 |
| 1.1.7 抗动植物病毒蛋白 |
| 1.2 真菌具生物活性蛋白质基因的结构研究与异源表达 |
| 1.2.1 真菌具生物活性蛋白质基因的分离与结构研究 |
| 1.2.2 真菌具生物活性蛋白质基因的克隆与异源表达 |
| 1.2.3 真菌具有物活性蛋白质表达体系 |
| 1.2.3.1 大肠杆菌表达体系 |
| 1.2.3.2 植物表达体系 |
| 1.2.3.3 酵母菌表达体系 |
| 1.2.3.4 丝状真菌表达体系 |
| 1.3 毛头鬼伞的生物活性物质 |
| 1.3.1 毛头鬼伞的概况 |
| 1.3.2 毛头鬼伞的活性多糖成分 |
| 1.3.3 毛头鬼伞的生物活性蛋白 |
| 1.3.4 毛头鬼伞的其他活性 |
| 1.4 本研究的目的、内容和意义 |
| 1.4.1 本研究的目的 |
| 1.4.2 本研究的内容 |
| 1.4.3 本研究的意义 |
| 第二章 抗性蛋白y3基因的DNA全长序列的分离 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用菌种 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 生物信息软件及网络资源 |
| 2.1.4 接头和引物 |
| 2.1.5 试剂及试剂盒 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.1.6.1 培养基 |
| 2.1.6.2 真菌基因组DNA提取用试剂 |
| 2.1.6.3 细菌质粒DNA提取用试剂 |
| 2.1.6.4 细菌感受态细胞制备用试剂 |
| 2.1.7 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种的培养和菌丝体的准备 |
| 2.2.2 基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.3.1 菌种的活化和培养 |
| 2.2.3.2 感受态的制备 |
| 2.2.4 YADE法分离基因y3DNA全长序列的策略 |
| 2.2.5 用YADE法扩增基因y3 5'-末端和3'-末端 |
| 2.2.5.1 DNA的酶切 |
| 2.2.5.2 接头的制备 |
| 2.2.5.3 连接 |
| 2.2.5.4 PCR扩增 |
| 2.2.6 扩增产物的电泳分离 |
| 2.2.7 琼脂糖凝胶中核酸片段的回收 |
| 2.2.8 回收片段与T-载体连接 |
| 2.2.9 大肠杆菌DH5α感受态细胞转化 |
| 2.2.10 质粒DNA的提取 |
| 2.2.11 重组质粒DNA的双酶切和PCR鉴定 |
| 2.2.11.1 重组质粒DNA的双酶切鉴定 |
| 2.2.11.2 重组质粒DNA的PCR鉴定 |
| 2.2.12 基因分离产物的序列测定 |
| 2.2.13 抗性蛋白y3基因DNA拟是全长序列的推测与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 基因组DNA酶切与抗性蛋白基因y3 5'-末端和3'-末端的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 抗性蛋白y3基因5'-末端和3'-末端的PCR扩增产物与T-载体的连接 |
| 2.3.3 基因分离产物的序列测定结果 |
| 2.3.3.1 抗性蛋白y3基因的5'-末端的测序结果 |
| 2.3.3.2 抗性蛋白y3基因的3'-末端的测序结果 |
| 2.3.4 抗性蛋白y3基因的DNA拟是全长序列的推测 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 YADE方法在TMV抗性蛋白y3基因的拟是全长DNA序列扩增中应用 |
| 2.4.2 YADE方法用于分离基因DNA序列的优点 |
| 第三章 抗性蛋白y3基因的cDNA全长序列的克隆 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用菌种 |
| 3.1.2 载体 |
| 3.1.3 生物信息软件及网络资源 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 试剂及试剂盒 |
| 3.1.6 主要试剂的配制 |
| 3.1.6.1 培养基 |
| 3.1.6.2 真菌总RNA提取用试剂 |
| 3.1.6.3 细菌质粒DNA提取用试剂 |
| 3.1.6.4 细菌感受态细胞制备用试剂 |
| 3.1.7 RNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌种的培养和菌丝体的准备 |
| 3.2.2 真菌菌丝体总RNA提取及残余DNA的去除 |
| 3.2.2.1 真菌菌丝体总RNA提取 |
| 3.2.2.2 真菌总RNA中残余DNA的去除 |
| 3.2.3 大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备 |
| 3.2.4 用5'-RACE分离抗性蛋白y3基因5'-末端序列的策略 |
| 3.2.5 用5'-RACE分离y3基因5'-末端序列的操作 |
| 3.2.5.1 cDNA第一链的合成 |
| 3.2.5.2 Hybrid RNA的分解 |
| 3.2.5.3 单链cDNA环化或形成首尾连接物 |
| 3.2.5.4 5'-末端未知序列的PCR扩增 |
| 3.2.6 扩增产物的电泳分离、核酸片段的回收、T-载体连接 |
| 3.2.6.1 扩增产物的电泳分离 |
| 3.2.6.2 琼脂糖凝胶中核酸片段的回收 |
| 3.2.6.3 回收片段与pMD18-T载体连接 |
| 3.2.7 大肠杆菌TOP10感受态细胞转化 |
| 3.2.8 质粒DNA的提取 |
| 3.2.9 重组质粒DNA的双酶切和PCR鉴定 |
| 3.2.9.1 重组质粒DNA的双酶切鉴定 |
| 3.2.9.2 重组质粒DNA的PCR鉴定 |
| 3.2.10 基因克隆产物的序列测定 |
| 3.2.11 克隆抗性蛋白y3基因的cDNA全长序列用引物的设计 |
| 3.2.12 用RT-PCR扩增抗性蛋白y3基因的cDNA全长序列 |
| 3.2.12.1 cDNA第一链的合成 |
| 3.2.12.2 cDNA全长序列的PCR扩增 |
| 3.2.13 扩增产物的电泳分离、胶回收、T-载体连接、转化与检测 |
| 3.2.13.1 扩增产物的电泳分离 |
| 3.2.13.2 琼脂糖凝胶中核酸片段的回收 |
| 3.2.13.3 回收片段与pMD18-T载体连接 |
| 3.2.13.4 大肠杆菌TOP10感受态细胞转化 |
| 3.2.13.5 质粒DNA的提取 |
| 3.2.13.6 重组质粒DNA的双酶切和PCR检测 |
| 3.2.14 抗性蛋白y3基因拟是cDNA全长序列的测定 |
| 3.2.15 抗性蛋白y3基因拟是cDNA全长序列的分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 抗性蛋白y3基因5'-RACE的结果 |
| 3.3.2 抗性蛋白基因cDNA全长序列的扩增 |
| 3.3.3 本研究所得cDNA序列与抗性蛋白Y3的cDNA序列的同源性比较 |
| 3.3.4 出自毛头鬼伞的一条新28S rRNA序列的发现和测序 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 核酸提取方法 |
| 3.4.2 关于5'-RACE方法的讨论 |
| 3.4.3 y3基因全长序列的同源性分析 |
| 3.4.4 012-019 片段的发现的启示 |
| 第四章 抗性蛋白y3基因的结构分析与28S rRNA的同源性探讨 |
| 4.1 抗性蛋白y3基因的结构分析 |
| 4.1.1 材料与方法 |
| 4.1.2 结果与分析 |
| 4.1.2.1 抗性蛋白基因y3的DNA与cDNA的结构比较分析 |
| 4.1.2.2 由cDNA序列推导的抗性蛋白Y3的氨基酸序列 |
| 4.1.2.3 抗性蛋白y3基因的cDNA序列与氨基酸序列比较 |
| 4.1.2.4 由cDNA序列推导的的氨基酸序列与先前报导的抗性蛋白Y3序列的比较 |
| 4.1.3 讨论与小结 |
| 4.2 毛头鬼伞中一条新28S rRNA同源性分析 |
| 4.2.1 材料和方法 |
| 4.2.1.1 生物学分析软件及聚类分析 |
| 4.2.1.2 聚类分析中参考的真菌核酸序列 |
| 4.2.1.2.1 来源于鬼伞属真菌的核酸序列 |
| 4.2.1.2.2 来源于非鬼伞属真菌的核酸序列 |
| 4.2.2 结果与分析 |
| 4.2.2.1 012-019片段在NCBI中的BLAST结果 |
| 4.2.2.2 聚类分析结果 |
| 4.2.2.3 不同基因之间同源序列区域与PCR扩增出现非目的片段之间的关系分析 |
| 4.2.3 讨论与小结 |
| 4.2.3.1 关于片段012-019的同源性确定 |
| 4.2.3.2 关于鬼伞属核糖体RNA(rRNA)的结构探讨 |
| 4.2.3.3 关于PCR扩增过程中出现非目的条带的讨论 |
| 第五章 抗性蛋白y3基因的植物表达质粒构建及烟草转化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验用菌种和植物 |
| 5.1.2 载体 |
| 5.1.3 生物信息软件及网络资源 |
| 5.1.4 引物 |
| 5.1.5 试剂及试剂盒 |
| 5.1.6 主要试剂的配制 |
| 5.1.6.1 培养基 |
| 5.1.6.2 DNA和RNA提取用试剂 |
| 5.1.6.3 细菌质粒DNA提取实验所用试剂 |
| 5.1.6.4 细菌感受态细胞制备所用试剂 |
| 5.1.6.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.1.6.6 Northern blot及核酸杂交用试剂 |
| 5.1.6.7 常用抗生素 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 真菌、植物培养及实验准备 |
| 5.2.1.1 真菌培养 |
| 5.2.1.2 植物培养 |
| 5.2.2 感受态细胞的制备 |
| 5.2.2.1 大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备 |
| 5.2.2.2 农杆菌LBA4404感受态细胞的制备 |
| 5.2.3 真菌菌丝体总RNA提取及残余DNA的去除 |
| 5.2.4 用于植物表达质粒构建的y3基因全长cDNA序列的扩增 |
| 5.2.5 扩增产物的电泳分离、胶回收、T-载体连接、转化与检测、序列测定等 |
| 5.2.6 抗性蛋白y3基因的植物表达质粒的构建 |
| 5.2.6.1 y3基因植物表达质粒构建的策略 |
| 5.2.6.2 y3基因与植物表达载体pBI121的重组 |
| 5.2.6.3 pBI121-y3与植物双元表达载体pCAMBIA1301的重组 |
| 5.2.6.4 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.7 用于农杆菌转化的pCAMBIA1301-y3质粒DNA的制备 |
| 5.2.8 农杆菌感受态细胞冻融法转化 |
| 5.2.8.1 pCAMBIA1301-y3质粒冻融法转化农杆菌感受态细胞 |
| 5.2.8.2 由农杆菌细胞中提取重组质粒DNA |
| 5.2.8.3 农杆菌重组质粒DNA的PCR及酶切鉴定 |
| 5.2.9 抗性蛋白y3基因的植物表达质粒叶盘法转化烟草 |
| 5.2.10 转基因阳性植株的筛选 |
| 5.2.10.1 转基因阳性植株的PCR筛选 |
| 5.2.10.2 转基因阳性植株的RT-PCR筛选 |
| 5.2.11 转基因阳性植株的鉴定 |
| 5.2.11.1 用Northern Blot鉴定y3基因在转基因烟草中的表达 |
| 5.2.11.2 用接种TMV的方法鉴定y3基因产物在转基因烟草中的抗病毒活性 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 毛头鬼伞y3基因的克隆及植物表达质粒构建 |
| 5.3.2 毛头鬼伞y3基因转化烟草 |
| 5.3.3 转基因烟草的筛选 |
| 5.3.4 抗性蛋白y3基因在植物体中表达的的鉴定 |
| 5.3.4.1 用Northern Blot鉴定y3基因在烟草中的表达 |
| 5.3.4.2 y3基因表达产物在转基因烟草中的抗病毒活性 |
| 5.3.5 讨论与小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）球孢白僵菌高渗适应性相关基因Bbmpd的克隆与表达分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 高渗敏感突变体的获得与T-DNA侧翼序列的克隆 |
| 1.3 Bbmpd的表达分析 |
| 1.4 同源重组载体构建 |
| 1.5 同源重组转化子的筛选与验证 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 球孢白僵菌1-磷酸甘露醇脱氢酶基因及上游序列的克隆与分析 |
| 2.2 Bbmpd的表达分析 |
| 2.3 Bbmpd同源重组转化子的筛选与验证 |
| 2.4 Bbmpd同源重组转化子的分析 |
| 3 讨论 |
（5）甘菊BADH基因启动子功能鉴定及诱导型启动子的分离（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语说明 |
| 1 观赏植物启动子研究进展 |
| 1.1 启动子的类型及其特点 |
| 1.1.1 组成型启动子 |
| 1.1.2 组织特异型启动子 |
| 1.1.3 诱导型启动子 |
| 1.2 启动子的分离方法 |
| 1.2.1 利用PCR技术克隆启动子 |
| 1.2.2 基于PCR的染色体步移技术 |
| 1.2.2.1 反向PCR |
| 1.2.2.2 锚定PCR步移法 |
| 1.2.2.3 利用载体的步移法 |
| 1.2.2.4 接头染色体步移法 |
| 1.2.2.5 随机引物搭配特异引物PCR法 |
| 1.2.2.6 TAIL-PCR法 |
| 1.2.2.7 YADE法 |
| 1.2.3 通过构建及筛选基因组文库来克隆启动子 |
| 1.2.4 利用启动子探针质粒载体筛选启动子 |
| 1.2.5 启动子捕获技术 |
| 1.2.6 几种启动子分离技术的比较及应用范围 |
| 1.3 启动子的研究方法 |
| 1.3.1 生物信息学方法 |
| 1.3.2 瞬间表达分析 |
| 1.3.3 转化分析 |
| 1.3.4 突变分析 |
| 1.4 启动子在观赏植物中的应用研究 |
| 1.4.1 花色 |
| 1.4.2 花期 |
| 1.4.3 抗性 |
| 1.4.3.1 抗生物胁迫 |
| 1.4.3.2 抗非生物胁迫 |
| 1.4.4 雄性不育系 |
| 1.4.5 株型 |
| 1.4.6 花型 |
| 1.4.7 延长植株观赏期 |
| 1.5 讨论 |
| 2 本研究的主要内容 |
| 3 高盐和干旱胁迫下甘菊甜菜碱合成途径结构基因表达研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器与试剂 |
| 3.1.2.1 试验仪器与设备 |
| 3.1.2.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.1.3.1 改良Trizol法提取甘菊总RNA |
| 3.1.3.2 逆转录合成cDNA第一链 |
| 3.1.3.3 实时荧光定量PCR |
| 3.1.3.4 甘菊叶片甜菜碱含量测定 |
| 3.1.3.5 甘菊叶片叶绿素含量测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 NaCl处理对甘菊植株生长的影响 |
| 3.2.2 NaCl胁迫处理下甘菊叶片中BADH基因表达及甜菜碱含量变化 |
| 3.2.2.1 甘菊BADH基因表达变化 |
| 3.2.2.2 甘菊甜菜碱含量变化 |
| 3.2.2.3 甘菊BADH基因和甜菜碱含量间的变化关系 |
| 3.2.3 干旱胁迫处理下甘菊叶片中BADH基因表达量的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BADH基因表达量的变化 |
| 3.3.2 甜菜碱含量的变化 |
| 3.3.3 BADH基因表达量与甜菜碱含量变化间的相互关系 |
| 3.4 结论 |
| 4 甘菊BADH基因4个启动子功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.1.1 植物材料 |
| 4.1.1.2 菌种与载体 |
| 4.1.1.3 生化试剂 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.2.1 农杆菌叶盘法转化烟草 |
| 4.1.2.2 转基因烟草的分化与生根培养 |
| 4.1.2.3 转基因烟草苗的鉴定 |
| 4.1.2.4 转基因烟草苗拷贝数的鉴定 |
| 4.1.2.5 转基因烟草的胁迫处理 |
| 4.1.2.6 转基因烟草GUS活性检测 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 转基因烟草植株的筛选与鉴定 |
| 4.2.2 实时荧光定量PCR法鉴定转基因烟草植株的拷贝数 |
| 4.2.3 不同启动子表达模式的鉴定 |
| 4.2.4 非生物胁迫下转基因烟草叶片中GUS活性变化 |
| 4.2.4.1 盐胁迫 |
| 4.2.4.2 ABA、SA、干旱和低温胁迫处理 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同启动子间的表达活性差异 |
| 4.3.2 MYB顺式作用元件响应胁迫诱导 |
| 4.4 结论 |
| 5 甘菊BADH基因启动子DBP12缺失片段功能鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.1.1 转化材料 |
| 5.1.1.2 菌种与材料 |
| 5.1.1.3 生化试剂 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.2.1 表达载体的构建 |
| 5.1.2.2 瞬时表达 |
| 5.1.2.3 农杆菌叶盘法转化烟草 |
| 5.1.2.4 转基因烟草植株的胁迫处理 |
| 5.1.2.5 转基因烟草GUS活性检测 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 植物表达载体的构建 |
| 5.2.1.1 中间表达载体的构建 |
| 5.2.1.2 植物表达载体的构建 |
| 5.2.1.3 植物表达载体的鉴定 |
| 5.2.1.4 植物表达载体转入农杆菌 |
| 5.2.2 瞬时表达结果 |
| 5.2.3 阳性烟草转化苗的筛选与鉴定 |
| 5.2.3.1 烟草转化苗的筛选 |
| 5.2.3.2 阳性转化苗的鉴定 |
| 5.2.4 DBP12启动子各缺失片段基础活性研究 |
| 5.2.5 转基因烟草胁迫处理 |
| 5.2.5.1 NaCl胁迫处理 |
| 5.2.5.2 干旱胁迫处理 |
| 5.2.5.3 ABA胁迫处理 |
| 5.2.5.4 低温胁迫处理 |
| 5.2.5.5 不同胁迫处理间的比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 各缺失片段对于胁迫的响应 |
| 5.3.2 5'-UTR对于启动子活性的影响 |
| 5.4 结论 |
| 6 甘菊诱导型启动子的克隆与序列分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.1.1 植物材料 |
| 6.1.1.2 菌种与材料 |
| 6.1.1.3 生化试剂 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.1.2.1 甘菊总DNA的提取 |
| 6.1.2.2 甘菊DNA的酶切 |
| 6.1.2.3 酶切后DNA的纯化及回收 |
| 6.1.2.4 酶切片段与Genome Walker Adaptor的连接 |
| 6.1.2.5 启动子序列的分离 |
| 6.1.2.6 表达载体的构建 |
| 6.1.2.7 瞬时表达 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 甘菊中响应盐诱导表达的基因启动子 |
| 6.2.2 启动子序列分析 |
| 6.2.3 植物表达载体的构建 |
| 6.2.4 瞬时表达结果与分析 |
| 6.3 讨论 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 附表一 |
| 附表二 |
| 个人简历 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（6）启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展（论文提纲范文）
| 1 启动子序列克隆的方法及其适用性 |
| 1.1 基因组文库筛选法 |
| 1.2 启动子探针载体筛选法 |
| 1.3 常规PCR法 |
| 1.4 反向PCR法 |
| 1.5 锅柄PCR法 |
| 1.6 序列特异性引物PCR法 |
| 1.7 热不对称交错式PCR法 |
| 1.8 Y型接头扩增法 |
| 2 启动子功能分析的方法及其策略 |
| 2.1 生物信息学法 |
| 2.2 实验分析法 |
| 2.2.1 点突变分析 |
| 2.2.2 凝胶阻滞分析 |
| 2.2.3 瞬间表达分析 |
| 2.2.4 转化分析 |
| 2.2.5 酵母单杂交分析 |
| 3 结语 |
（7）矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1.植物MADS-box基因特点及AGL15亚家族基因研究进展 |
| 1.2.高等植物启动子的研究进展 |
| 1.2.1.高等植物启动子的结构特征 |
| 1.2.2.高等植物启动子的分类 |
| 1.2.3.植物基因启动子的克隆方法 |
| 1.2.4.启动子结构和功能的研究方法 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌种和载体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要设备 |
| 3.1.5 常用溶液配方 |
| 3.2 实验方法及操作过程 |
| 3.2.1 植物总DNA的提取、纯化及限制性酶切 |
| 3.2.2 YADE法扩增启动子序列 |
| 3.2.3 扩增片断回收 |
| 3.2.4 连接反应 |
| 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.7 重组子PCR鉴定 |
| 3.2.8 序列测定 |
| 第4章 PMADS9基因cDNA5'端RACE检测启动子 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌种和质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要设备(同3.1.4) |
| 4.1.5 常用溶液配方(同3.1.5) |
| 4.2 实验方法及操作过程 |
| 4.2.1 植物总RNA提取及cDNA合成 |
| 4.2.2 利用5'端RACE技术扩增PMADS9 cDNA5'末端序列 |
| 4.3 序列比对分析 |
| 第5章 构建启动子的克隆载体、表达载体及瞬时表达载体 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌种和质粒 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要设备 |
| 5.1.5 常用溶液配方(同3.1.5) |
| 5.2 实验方法及操作过程 |
| 5.2.1 加酶切位点PCR引物的设计 |
| 5.2.2 PCR获得加有酶切位点的prom启动子片段 |
| 5.2.3 克隆载体pMD-prom的构建 |
| 5.2.4 表达载体pC1381Z-prom的构建 |
| 5.2.5 瞬时表达载体pMD-prom-Gus的构建 |
| 第6章 分析及讨论 |
| 6.1 PMADS9基因启动子prom的在线分析 |
| 6.2 启动子prom的GenBank登录 |
| 6.3 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 后续研究 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（8）棉花GaMYB7和GbGLU基因启动子的克隆和初步功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 棉花启动子概述 |
| 1 启动子的概述 |
| 1.1 启动子的概念和特征 |
| 1.2 启动子的结构模型 |
| 1.3 利用PCR技术克隆启动子 |
| 1.4 启动子的分类 |
| 2 棉花纤维发育相关启动子 |
| 2.1 棉纤维发育相关基因的研究进展 |
| 2.2 棉花纤维相关启动子的研究进展 |
| 3 棉花抗病相关基因启动子 |
| 3.1 GbGLU(β-1,3-葡聚糖酶)基因的研究进展 |
| 3.2 植物抗病相关启动子的研究进展 |
| 4 BAC文库在启动子克隆上的应用 |
| 4.1 BAC文库的定义 |
| 4.2 棉花品种BAC文库在相关启动子克隆上的应用 |
| 5 棉花遗传转化方法 |
| 5.1 基因枪法 |
| 5.2 根癌农杆菌介导法 |
| 5.3 PEG介导法 |
| 5.4 花粉管通道法 |
| 本研究的目的和意义 |
| 本研究的技术路线 |
| 第二部分 研究报告 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 BAC文库材料 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BAC文库中含有目的基因的单克隆的筛选 |
| 2.2 BAC文库中目的单克隆质粒DNA的提取 |
| 2.3 TAIL-PCR反应引物的设计及合成 |
| 2.4 TAIL-PCR反应产物的电泳、回收、克隆及测序 |
| 2.5 序列分析 |
| 2.6 启动子缺失载体的构建 |
| 2.7 启动子缺失载体的基因枪瞬时表达 |
| 2.8 GaMYB7基因的定量分析 |
| 2.9 农杆菌介导的启动子缺失载体的转化 |
| 2.10 农杆菌介导转化烟草 |
| 第三章 结果和分析 |
| 1.GaMYB7基因启动子的筛选和克隆分析 |
| 1.1 BAC文库的筛选 |
| 1.2 TAIL-PCR |
| 1.3 GaMYB7基因5'上游片段的序列分析 |
| 1.4 GaMYB7基因的定量分析 |
| 1.5 GaMYB7基因启动子缺失载体的构建 |
| 1.6 缺失载体的基因枪瞬时表达研究 |
| 1.7 棉花胚性愈伤的GUS表达 |
| 2 GbGLU基因启动子的筛选和克隆分析 |
| 2.1 BAC文库的筛选 |
| 2.2 TAIL-PCR |
| 2.3 GbGLU基因5'上游片段的序列分析 |
| 2.4 GbGLU基因启动子的5'端缺失载体的鉴定 |
| 2.5 启动子的5'端缺失载体转化棉花 |
| 2.6 启动子的5'端缺失载体转化烟草 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BAC文库的应用 |
| 3.2 TAIL-PCR扩增 |
| 3.3 物表达载体的构建 |
| 3.4 基因枪瞬时表达 |
| 3.5 农杆菌介导的棉花遗传转化 |
| 4 后续工作建议 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）棉花基因GhHOX2启动子的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一、文献综述 |
| 1.1 棉花概述 |
| 1.1.1 棉花的植物学分类 |
| 1.1.2 棉花的染色体组分类 |
| 1.1.3 棉花纤维的发育过程 |
| 1.1.4 棉花纤维发育基因功能研究的意义 |
| 1.2 植物转录因子研究进展 |
| 1.2.1 植物转录因子概述 |
| 1.2.2 转录因子的结构 |
| 1.2.3 转录因子的功能 |
| 1.2.4 转录因子控制植物细胞分化 |
| 1.2.5 棉花转录因子研究 |
| 1.3 植物启动子研究 |
| 1.3.1 启动子功能分析在基因功能中的研究意义 |
| 1.3.2 植物启动子的一般结构 |
| 1.3.3 植物启动子克隆与研究方法 |
| 二、引言 |
| 2.1 论文的立论依据 |
| 2.2 论文的技术路线 |
| 三、材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要仪器与试剂 |
| 3.1.4 主要缓冲液配方 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 GhHOX2的表达分析与基因组结构分析 |
| 3.2.2 启动子序列克隆 |
| 3.2.3 全基因序列克隆 |
| 3.2.4 表达载体构建 |
| 3.2.5 烟草的遗传转化 |
| 3.2.6 转基因植株的PCR验证 |
| 3.2.7 GUS的组织化学染色及观察 |
| 四、结果与分析 |
| 4.1 GhHOX2的基因组结构与表达分析 |
| 4.2 启动子序列克隆 |
| 4.3 棉花pHOX2-1和pHOX2-2启动子来自同一个基因GhHOX2 |
| 4.4 表达载体构建 |
| 4.5 启动子在农杆菌重组菌株中的定性分析 |
| 4.6 pHOX2-2启动子指导GUS在转基因烟草中的表达分析 |
| 4.7 pHOX2-1启动子指导GUS在转基因烟草中的表达分析 |
| 五、讨论 |
| 5.1 棉花基因GhHOX2两个启动子的起源 |
| 5.2 利用平端酶YADE法进行棉花启动子克隆 |
| 5.3 棉花基因GhHOX2在两个启动子的功能差异 |
| 六、结论 |
| 七、参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文及参加课题 |
（10）五个异源启动子在烟草与棉花中的表达特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一 文献综述 |
| 1.1 植物启动子的结构及类型 |
| 1.1.1 启动子的主要结构 |
| 1.1.1.1 转录起始位点(transcription start site) |
| 1.1.1.2 TATA框 |
| 1.1.1.3 植物中常见的其它启动子元件 |
| 1.1.2 植物基因启动子的类型 |
| 1.1.2.1 组成型启动子 |
| 1.1.2.2 特异表达型启动子 |
| 1.1.2.3 诱导型启动子 |
| 1.2 常用的植物启动子研究方法 |
| 1.2.1 启动子的分离 |
| 1.2.1.1 利用常规PCR技术分离启动子 |
| 1.2.1.2 通过构建基因组文库来克隆启动子 |
| 1.2.1.3 启动子诱捕(Promoter Trapping)技术 |
| 1.2.1.4 环状 PCR |
| 1.2.1.5 锚定PCR |
| 1.2.1.6 Y型接头DNA序列延伸(YADE)法 |
| 1.2.2 启动子功能分析方法 |
| 1.2.2.1 植物转化分析 |
| 1.2.2.2 瞬时表达分析 |
| 1.2.2.3 点突变分析 |
| 1.3 棉花基因工程启动子的研究进展 |
| 1.3.1 棉花简介 |
| 1.3.2 棉花基因工程的启动子研究 |
| 1.3.3 棉花启动子研究的问题及解决策略 |
| 二 引言 |
| 2.1 论文的立论依据 |
| 2.2 论文的技术路线 |
| 三 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株、启动子及表达载体 |
| 3.1.3 主要试剂和仪器设备 |
| 3.1.4 主要缓冲液和培养基配方 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 转化用农杆菌菌液的培养 |
| 3.2.2 烟草遗传转化 |
| 3.2.3 棉花遗传转化 |
| 3.2.4 转化植株的PCR鉴定 |
| 3.2.4.1 转基因烟草的PCR验证 |
| 3.2.4.2 转基因棉花的PCR验证 |
| 3.2.5 DNA的提取 |
| 3.2.5.1 烟草基因组DNA的提取 |
| 3.2.5.2 棉花基因组DNA的提取 |
| 3.2.6 转化植株的GUS表达特性分析 |
| 3.2.7 显微观察 |
| 3.2.7.1 材料的固定、脱水和包埋 |
| 3.2.7.2 切片、脱蜡、封片和观察 |
| 四 结果与分析 |
| 4.1 组织特异启动子在烟草中的表达分析 |
| 4.1.1 转基因烟草植株的获得及PCR验证 |
| 4.1.2 特异启动子在烟草中的表达 |
| 4.1.2.1 AAP1启动子在烟草中的表达特性 |
| 4.1.2.2 NtSC启动子在烟草中的表达特性 |
| 4.1.2.3 BAN启动子在烟草中的表达特性 |
| 4.1.2.4 PV启动子在烟草中的表达特性 |
| 4.1.2.5 AAP2启动子在烟草中的表达特性 |
| 4.2 特异启动子在棉花中的表达特性 |
| 4.2.1 转基因棉花的获得及PCR验证 |
| 4.2.2 各启动子在转基因棉花中的表达特性 |
| 4.2.2.1 BAN在转基因棉花中的表达模式 |
| 4.2.2.2 AAP2在转基因棉花中的表达 |
| 4.2.2.3 AAP1在转基因棉花中的表达情况 |
| 4.2.2.4 NtSC在转基因棉花中的表达情况 |
| 五 讨论 |
| 5.1 组织特异启动子在双子叶植物中的表达 |
| 5.2 组织特异启动子在棉花中的应用 |
| 六 结论 |
| 6.1 启动子在烟草中的表达具有种子或维管束特异性 |
| 6.2 启动子在棉花中的表达具有特异性 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
四、利用YADE法进行棉花基因组PCR步行（论文参考文献）
- [1]矮牵牛PMADS9基因的启动子克隆与功能分析[D]. 陈君. 西南大学, 2011(09)
- [2]矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及分析[J]. 郭余龙,闫明旭,陈君,马婧,李名扬. 植物遗传资源学报, 2011(02)
- [3]担子菌毛头鬼伞的TMV抗性蛋白y3基因的分离、鉴定和表达[D]. 王学仁. 西北大学, 2010(09)
- [4]球孢白僵菌高渗适应性相关基因Bbmpd的克隆与表达分析[J]. 罗志兵,金凯,张永军,武增强,裴炎. 微生物学报, 2010(06)
- [5]甘菊BADH基因启动子功能鉴定及诱导型启动子的分离[D]. 曹华雯. 北京林业大学, 2010(09)
- [6]启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展[J]. 杨晓娜,赵昶灵,李云,李会容,苏丽,周燕琼. 云南农业大学学报(自然科学版), 2010(02)
- [7]矮牵牛PMADS9基因启动子的克隆及功能分析[D]. 闫明旭. 西南大学, 2009(09)
- [8]棉花GaMYB7和GbGLU基因启动子的克隆和初步功能验证[D]. 陆亚敏. 南京农业大学, 2008(08)
- [9]棉花基因GhHOX2启动子的克隆与功能分析[D]. 刘灏. 西南大学, 2008(09)
- [10]五个异源启动子在烟草与棉花中的表达特性研究[D]. 罗凤涛. 西南大学, 2008(S2)