一、EFFECTS OF TOTAL SAPONINS OF PANAX NOTOGINSENG AND LIGUSTRAZINE ON THE PROLIFERATION OF CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS OF RATS（论文文献综述）
谢欣序[1]（2021）在《降香及替代药材对HMWD导致的微循环障碍的影响和其主治相关疾病作用机制的网络药理学探讨》文中研究表明目的:根据降香在中医药传统理论中其功能主治为化瘀止血、理气止痛的概述,本课题采用高分子右旋糖酐致大小鼠微循环障碍模型来对比降香及其替代药材交趾黄檀在化瘀止血方面功效的异同,并采用网络药理学来探讨降香功能主治相关疾病的作用机制,为交趾黄檀替代降香提供一定理论基础,以及为后续机制研究提供数据支撑。第一部分:降香及其替代药材抗高分子右旋糖酐导致的微循环障碍比较研究方法:将80只KM小鼠雄性按体重随机分为8组,每组10只,降香水提物高组（10g生/kg）,降香水提物低组（5g生/kg）,挥发油高组（10g生/kg）,挥发油低组（5g生/kg）,前列地尔组（0.75ug/kg）,血塞通（45mg/kg）,模型组,正常组,各组动物连续7天给予相应药物,每天一次;正常组尾静脉注射相同体积的生理盐水溶液;在实验过程中,每隔一天记录小鼠体重。第7天,水合氯醛400mg/kg麻醉小鼠,用剪刀剪去耳廓的细毛,耳廓微循环测量仪测小鼠耳廓小动脉及小静脉直径作为初始值,待小鼠苏醒后给药;给药1h后每只动物尾静脉注射10%HMWD溶液,5ml/kg;正常组尾静脉注射相同体积的生理盐水溶液;再次用水合氯醛400mg/kg麻醉小鼠,测造模后小鼠耳廓小动脉及小静脉直径。将120只SD大鼠雄性按体重随机分为10组,每组12只,降香水提高组（6g生药材/kg）、降香水提中组（3g生药材/kg）、降香水提低组（1.5g生药材/kg）、交趾水提高组（6g生药材/kg）、交趾水提中组（3g生药材/kg）、交趾水提低组（1.5g生药材/kg）、血塞通组（30mg/kg）、前列地尔组（0.45ug/kg）、模型组、正常组,各组动物连续7天给予相应药物,给药1h后除正常组外每只动物尾静脉注射用生理盐水溶液配制的10%HMWD溶液,10ml/kg,正常组尾静脉注射相同体积的生理盐水溶液。第7天,采用水合氯醛300mg/kg麻醉大鼠,测第7次注射HMWD前后大鼠肠系膜微血管直径并记录微血管红细胞流速,采用powerlab记录各组动物心电及左颈动脉压。检测后对各组动物进行腹主动脉采血,检测其血液流变学指标,全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞变形指数、血小板数;对各组动物进行肺部拍照,并对肺部组织进行出血点及瘀血进行评分,检测各组动物血清中NO、ET-1、TXB2、6-keto-PGF1-α、PAI-1和t-PA含量,另外检测各组动物血清中AST、CK-MB、LDH、CK含量。结果:1、一般观察:小鼠实验中,前列地尔组体重较模型组体重有下降,但无显着性差异,其他给药组动物与模型组比较无明显差异;大鼠实验中,各给药组动物与模型组比较体重无明显差异;提示降香水提物、降香油、交趾黄檀水提物对大小鼠体重无明显影响。2、小鼠耳廓微循环小血管变化:小鼠尾静脉注射右旋糖酐后,小鼠耳廓中小静脉直径较给药前明显下降,小动脉直径下降不明显,模型组小鼠耳廓动脉比造模后明显升高,降香油高低组、降香水提物高组、交趾黄檀高低组小静脉直径与模型组比较下降不明显,动静比差值显着性下降。3、肺脏表观出血评分结果:对各组大鼠进行肺脏表观观察,发现模型组肺脏与正常组比较可见陈旧的点状及片状瘀血斑点,各给药组情况较模型组点状及片状瘀血斑点较模型组少,进行评分,降香水提高、中组、交趾黄檀水提高组评分较模型组明显下较,显示降香及交趾黄檀水提物能改善大鼠肺部瘀血情况4、肠系膜微血管直径及红细胞流速结果:从肠系膜微血管直径变化来看,第7次注射高分子右旋糖酐前后肠系膜微血管直径有较小上涨的趋势。其中降香高剂量组、降香低剂量组、交趾高剂量组有与模型组比较其为血管直径升高,且有显着性差异。从微血管红细胞流速来看,第7次注射高分子右旋糖酐后,模型组与正常组比较其红细胞流速明显下降,降香高组、降香中组与模型组比较,其红细胞流速较明显升高,交趾高组、交趾中组与模型组比较,其红细胞流速较明显升高。5、血流动力学指标与血液流变学指标:心电方面,模型组和正常组比较,T波高耸,T-S值,T/R值明显升高,降香高、中组、交趾高组与模型组比较,其T-S值,T/R值明显下降。左颈动脉压,模型组与正常组比较无明显差异,各给药组左颈动脉压与模型组比较无明显。6、血液流变学指标:降香高、中组,交趾高、中组能够明显降低全血黏度（高切、中切、低切）;降香高组、交趾高、中组能够明显降低红细胞聚集指数。7、血清中舒张血管及纤溶指标检测:降香高、中组,交趾高组能够明显提高血清中NO含量,降香高组、交趾高、中组明显降低血清中ET-1含量。交趾高组能明显降低血清中TXB2含量,降香高组、交趾高组能明显升高血清中6-keto-PGF1-α含量;降香高组、交趾高组能明显升高TXB2/6-keto-PGF1-α含量。降香及交趾黄檀对血清中PAI-1和t-PA含量无明显影响8、降香及交趾黄檀具降低血清中AST、CK-MB、LDH、CK含量的趋势。第二部分:基于网络药理学探讨降香功能主治相关疾病的作用机制方法:利用TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM数据库分析降香中的有效活性成分,获取降香有效成分的作用靶点。利用Gene Card、OMIM、Dis Ge NET数据库和GEO基因芯片整合NASH、AMI、动脉粥样硬化（vascular disease）的作用靶标。运用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络（PPI）,采用Cytoscape 3.8.0软件构建药物活性成分-疾病-靶点网络模型进行分析,借助Matescape和DAVID在线工具对关键靶点进行基因本体功能注释（GO）和东京基因组百科全书（KEGG）通路富集分析,并用SYBYL2.0软件对HUB基因进行分子对接验证,采用HPA数据库分析关键靶标蛋白在人体不同组织和细胞中的表达水平。结果:1、降香中37种有效活性成分的预测靶标有105个,GO分析表明,降香可参与多种生物学过程,尤其是对血液循环以及细胞膜电位的调节,其中79个靶点与NASH、AMI和vascular disease相关,共同靶点22个。2、基于22个共同靶点构建降香靶点与NASH、AMI和vascular disease共同靶点的相互作用网络（PPI）和GO、KEGG富集分析,确定了CASP3、MAP K14、PTGS2、PPARG和HMOX1等关键靶点,表明降香有效成分主要作用在细胞的膜筏、胞质溶胶、质膜、细胞核和核质,参与缺氧反应,雌二醇反应,信号转导,细胞增殖等生物过程,影响调控血清素激活的突触,钙信号通路,Erb B信号通路,HIF-1信号等相关通路,3、分子对接结果显示降香中β-谷甾醇、阔叶黄檀酚、消旋的异剑叶莎属异黄烷和牛角花酮等关键化合物与CASP3、MAPK14、PTGS2、PPARG等关键靶点有较好的结合能力。结论:1、降香及交趾黄檀对大小鼠体重无明显影响,降香及交趾黄檀具有扩张小鼠耳廓微血管作用,降香及其替代药材交趾黄檀能够明显增加肠系膜微血管的血液红细胞流速,降香及交趾黄檀能够明显改善肺脏表面出血情况,降香及交趾黄檀能够降低T-S值,T/R值,全血黏度,红细胞聚集指数;降香及交趾黄檀能够提高血清中NO含量并降低ET-1含量;另外降香及交趾黄檀也能够提高血清中6-keto-PGF1-α含量并降低TXB2含量。2、本研究以中药降香活性成分为研究对象,通过网络药理学的手段分析了其作用NASH、AMI和Vascular disease可能的共同靶标及途径机制,建立“化合物-靶标-通路-疾病-分子对接”的中药网络药理学研究模式,从多个角度揭示了降香通治疗NASH、AMI和Vascular disease的调控网络。从分析结果来看降香中的各活性成分组要涉及的靶点有CASP3、MAPK14、PTGS2、PPARG和HMOX1,主要作用在细胞的膜筏、胞质溶胶、质膜、细胞核和核质,参与缺氧反应,雌二醇反应,信号转导,细胞增殖等生物过程,影响调控血清素激活的突触,钙信号通路,Erb B信号通路,HIF-1信号等相关通路。
周东蕊[2]（2021）在《血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究》文中进行了进一步梳理研究目的:1.观察血塞通注射液对大鼠大脑中脉闭塞（MCAO）28天神经功能的影响,探究血塞通对损伤皮层LINGO-1,EGFR,PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。2.观察血塞通注射液对体外培养SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）损伤的保护作用,验证血塞通注射液对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的调节作用。研究方法:1.采用改良的Longa法对SD大鼠进行MCAO模型的制备,假手术组大鼠只进行皮肤切开以及钝性分离血管和神经,不插入栓线。大鼠MCAO模型的成功建立评价方法选用TTC染色法。2.根据术后Longa评分将手术组大鼠随机分为模型组,血塞通小剂量组,血塞通大剂量组和尼莫地平组（即阳性药物组）。假手术组和模型组注射同等剂量的生理盐水,其余组别给与相对应的药物治疗。术后1-28天,每日清晨给药前对大鼠进行称重,根据mNSS神经功能评分表进行评分。评价血塞通对大鼠MCAO术后不同时间点（7天,14天和28天）神经功能和体重恢复的疗效。MCAO术后28天,将所有大鼠麻醉后断头取脑,采用HE染色观察大鼠大脑皮层的病理变化,采用Western blot法检测皮层梗死侧的SYN和PSD-95的蛋白表达变化,探索血塞通注射液对皮层梗死区的神经保护作用。采用qRT-PCR、免疫组织化学（IHC）和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层LINGO-1,EGFR以及PI3K/AKT的mRNA和蛋白表达,探索血塞通的神经保护机制。3.采用qRT-PCR和Western Blot检测MCAO术后28天大鼠大脑皮层PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达,进一步探索血塞通的神经保护机制。4.体外培养SH-SY5Y细胞,CCK-8法确定最佳缺氧时间,建立OGD/R损伤SH-SY5Y细胞模型,CCK-8法确定血塞通和bpV的最适药物浓度。将SH-SY5Y细胞随机分为正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组等5个组别,按照不同组别给与相对应的药物,正常组给与无血清的EBSS液,模型组给与无糖的Earle’s液。镜下观察血塞通对OGD/R损伤SHSY-5Y细胞生长状态的影响。采用qRT-PCR和Western Blot检测OGD/R损伤SH-SY5Y细胞的PI3K/AKT以及PTEN和GSK-3β的mRNA和蛋白表达对体内实验进一步验证,观察当使用bpV时,PTEN及其下游的PI3K/AKT通路、GSK-3β mRNA和蛋白的表达情况。研究结果:1.TTC染色显示:假手术组大鼠右脑为均一的红色,表明脑组织并未损伤;手术组大鼠由于大脑右侧被梗塞而出现广泛的白色,表明MCAO可诱导大鼠右侧脑组织梗死。研究结果证明大鼠MCAO模型成功建立。2.各组大鼠的体重在造模前未见显着的差异（P>0.05）;在MCAO术后第7天和第14天,各组大鼠体重均明显低于假手术组（P<0.05或者P<0.01）;术后第28天,除模型组外,各药物治疗组大鼠的体重与假手术组没有明显差异（P>0.05）。术后第14天的假手术组大鼠的体重高于第7天假手术组的体重,余组别两个时间点比较未见明显差异（P>0.05）;而第28天各组大鼠的体重均显着高于第14天相同组别的大鼠（P<0.01）。手术组各组大鼠苏醒后EZ-Longa评分组间未见明显差异（P>0.05）。在第7天的mNSS评分中,血塞通大剂量组明显低于模型组（P<0.05）。药物治疗后14天,血塞通治疗组（包括小剂量和大剂量）和尼莫地平组大鼠的mNSS评分与模型组相比显着降低（P<0.05）。而药物治疗后28天,血塞通治疗组大鼠的mNSS评分与模型组相比明显降低（P<0.05或P<0.01）;血塞通大剂量组在降低大鼠的mNSS评分方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05）。这说明血塞通治疗可长期缓解MCAO大鼠的神经功能障碍,且具有剂量依赖性。MCAO术后相同组别的mNSS评分在不同时间点的比较显示:第7天和第14天同一组别的mNSS评分无显着差异（P>0.05）;除尼莫地平组外,第28天的mNSS评分显着高于同一组别第14天的mNSS评分（P<0.05）。MCAO术后28天,HE染色结果显示:假手术组大鼠的脑组织形态和细胞结构完整。模型组大鼠脑组织呈大面积损伤,组织着色较浅,神经细胞坏死、核固缩、深染;治疗组大鼠的脑组织也出现一定的损伤,但是和模型组相比,损伤程度较轻,神经细胞的数量也多;与血塞通小剂量组和尼莫地平组相比,血塞通大剂量组的脑组织结构更完整,神经细胞数量亦明显增多。MCAO术后28天,与模型组相比较,各治疗大鼠的PSD-95蛋白表达显着升高（P<0.01）;对各治疗进行比较发现,血塞通大剂量组在提高PSD-95表达方面显着优于血塞通小剂量组和尼莫地平组（P<0.05或P<0.01）。与模型组相比,血塞通大剂量组和尼莫地平组可显着提高大鼠大脑皮层SYN蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）;与血塞通小剂量组相比,血塞通大剂量组在提高SYN蛋白表达方面具有显着的优势（P<0.05）。MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:各组LINGO-1,EGFR,PI3K以及AKT mRNA表达无显着变化（P>0.05）。IHC结果显示:LINGO-1的阳性颜色为深棕色,假手术组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达较少;各治疗组大鼠脑组织LINGO-1的阳性表达显着低于模型组的阳性表达（P<0.01）;而对各治疗组之间皮层LINGO-1的阳性表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。各组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的阳性颜色均为深棕色,假手术组大鼠脑组织P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT呈低表达;各治疗组大鼠大脑皮层P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达显着高于模型组（P<0.01）;对各治疗组之间的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT的表达进行比较发现,组间未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:各治疗组大鼠的Lingo-1蛋白的相对表达相较于模型组显着下降（P<0.01）,接近正常水平;而各治疗组之间进行比较,Lingo-1的表达未见明显差异（P>0.05）。各治疗组的P-EGFR,P-PI3K以及P-AKT高于模型组（有趋势,或P<0.05,或P<0.01）;治疗组之间比较无明显差异（P>0.05）。3.MCAO术后28天,qRT-PCR结果显示:除血塞通大剂量组的大鼠脑组织的PTEN mRNA表达明显高于假手术组的mRNA（P<0.05）,其余各组大鼠脑组织的PTEN mRNA表达组间比较未见显着差异（P>0.05）;各组大鼠脑组织的GSK-3β mRNA表达组间亦未见显着差异（P>0.05）。Western blotting结果显示:与模型组相比,各治疗组的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;而各治疗组之间的P-PTEN和P-GSK3β相对蛋白水平无明显差异（P>0.05）。4.CCK-8法检测SH-SY5Y细胞的最佳缺氧时间为7 h;血塞通和bpV对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的最适药物浓度分别为20μg/ml和1μmol/L。通过镜下观察血塞通,bpV以及血塞通+bpV对OGD 7 h/R 24 h培养的SH-SY5Y细胞生长状态的影响发现,血塞通组、bpV组以及血塞通+bpV组的贴壁细胞数量较模型组多,大部分细胞呈多边形或梭形,部分细胞突触缩短,但大部分细胞突触仍存在,各治疗组之间的细胞形态未见明显的差异。SH-SY5Y细胞OGD 7h/R24 h培养后,qRT-PCR结果显示:正常组,模型组,血塞通组,bpV组以及血塞通+bpV组细胞的PI3K,AKT,PTEN和GSK-3β mRNA的水平未见显着差异（P>0.05）。Western blotting检测结果显示,与模型组相比,各治疗组大鼠大脑皮层的 P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN 以及 P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平显着升高（P<0.05,或P<0.01）;各治疗组之间的P-PI3K/PI3K,P-AKT/AKT,P-PTEN/PTEN以及P-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平比较未见明显差异（P>0.05）。研究结论:1.血塞通可以长期缓解MCAO大鼠的脑组织损伤并促进神经重塑和再生从而增加MCAO术后大鼠的体重,改善MCAO大鼠的神经功能。2.血塞通发挥的神经保护作用机制包括抑制LINGO-1表达,激活EGFR和PI3K/AKT信号通路,抑制PTEN的表达进一步激活PI3K/AKT通路,从而抑制下游GSK-3β的活性,长期促进突触的重塑和再生。3.血塞通可以缓解OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤,通过抑制PTEN的活性,激活其下游PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,发挥长期的神经保护作用。
欧阳波[3]（2021）在《冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元保护作用的研究》文中提出目的:研究冰片配伍黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ,AST Ⅳ）和三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对大鼠脑缺血/再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）后脑组织损伤、神经血管单元主要组分（神经元、星形胶质细胞和微血管）的结构、主要组分特异蛋白--胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillary acidic protein,GFAP）、神经元特异性核蛋白（Neuron specific nuclear,Neu N）、层黏连蛋白（Laminin,LN）、内皮屏障抗原蛋白（Endothelial barrier antigen,EBA）及相关功能蛋白--αII-血影蛋白（αII-Spectrin,αII-SP）、水通道蛋白4（Aquaporin 4,AQP-4）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响,探讨其通过Notch信号通路对神经血管单元的保护机制。方法:成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组（Sham Operation Group,SOG）、模型组（Model Group,MG）、冰片组（Borneol Group,BG）、AST Ⅳ组（AST Ⅳ Group,AG）、PNS组（PNS Group,PG）、AST Ⅳ+PNS组（AST Ⅳ+PNS Group,APG）、冰片+AST Ⅳ+PNS低剂量组（Borneol+AST Ⅳ+PNS Low-dose Group,LDG）、冰片+AST Ⅳ+PNS高剂量组（Borneol+AST Ⅳ+PNS High-dose Group,HDG）、依达拉奉组（Edaravone Group,EG）。EG腹腔注射给药,其他组灌胃给药,2次/d。采用线栓法阻断右侧大脑中动脉（Middle cerebral artery,MCA）,建立大鼠CIRI模型。缺血2h,再灌注后22h,行神经功能缺损评分,TTC染色测定脑梗死体积,HE染色观察大脑缺血皮质区病理形态;免疫组化法检测大脑缺血皮质区GFAP、Neu N、LN、EBA的表达;免疫荧光三标法检测大脑缺血皮质区GFAP、神经丝蛋白200（neurofilament-200,NF-200）、LN的蛋白表达;Westrn blot检测大脑缺血皮质区αII SP、AQP-4、MMP-9、VEGF、Notch1、Notch胞内域（Intracellular domain of Notch,NICD）、Hes1、Delta-like ligand 4（DLL4）蛋白的表达。结果:缺血2h,再灌注22h后,MG出现神经功能缺损、右侧局灶性脑梗死、神经细胞损伤。各药物组神经功能缺损评分、脑梗死体积和神经细胞损伤率显着降低（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。缺血2h,再灌注22h后,免疫组化结果显示,MG的Neu N、LN、EBA阳性细胞显着减少（P<0.01）,GFAP阳性细胞显着增加（P<0.01）;冰片、PNS、AST Ⅳ、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强Neu N、LN、EBA蛋白表达（P<0.05、0.01）,显着降低GFAP蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。免疫荧光三标结果显示,MG的NF-200、LN阳性细胞显着减少（P<0.01）,GFAP阳性细胞显着增加（P<0.01）;冰片、AST Ⅳ、PNS、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着降低GFAP蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强LN蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强NF-200蛋白表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于AST Ⅳ+PNS（P<0.05）。Westrn blot结果显示,MG大鼠缺血皮质区AQP-4、MMP-9蛋白表达显着增加（P<0.05）,αII SP蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,而VEGF、NICD、Notch1、Hes1、DLL4蛋白表达无显着变化（P>0.05）,冰片+AST Ⅳ+PNS能显着上调αII SP、VEGF、NICD、Notch1、Hes1、DLL4蛋白的表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片+AST Ⅳ+PNS能显着下调AQP-4、MMP-9蛋白的表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。结论:1.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后具有脑保护作用,能改善神经功能缺损、降低神经细胞损伤率、减少脑梗死体积,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS。2.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后神经血管单元具有保护作用,可减轻神经元和微血管基底膜损伤、抑制星形胶质细胞过度活化、减轻脑水肿,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS。维持神经血管单元结构完整性,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于AST Ⅳ+PNS。3.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后的脑保护作用机制可能与激活Notch信号通路,上调NICD、Notch1、Hes1、VEGF、DLL4表达,从而发挥对缺血脑组织的保护作用有关。
朱婷[4]（2021）在《三七皂苷R1对缺血性脑卒中的神经修复作用及分子机制研究》文中认为背景脑卒中发病人群中大约有87%属于缺血性脑卒中。目前,溶栓和血栓切除术是治疗急性缺血性脑卒中的有效方法。但是,由于严格的时间窗（4.5 h以内）限制以及增加出血风险等不良反应,该种方法只能应用于少数患者。神经保护剂仍然是急性缺血性脑卒中治疗的有效方法,即抑制缺血半暗带神经元等细胞的死亡。到目前为止,单纯采取神经保护剂治疗的策略在实际临床治疗中疗效并不显着,采取有效方法修复神经血管单元的所有组分是促进神经修复的关键策略。三七皂苷制剂广泛用于缺血性脑卒中,三七皂昔R1（notoginsenoside R1,NGR1）是三七皂苷中分离出的特有皂苷成分。前期课题组研究发现,NGR1预防给药对缺血性脑卒中急性期的损伤具有明显的神经保护作用,但NGR1治疗给药能否对缺血性脑卒中神经修复期起到显着作用尚缺乏报道。目的本课题从血管新生（angiogenesis）和神经发生（neurogenesis）两个关键环节,通过深入挖掘NGR1促进缺血性脑卒中神经修复的作用途径和关键靶点,系统阐明NGR1促进缺血性脑卒中神经修复的作用机制,为进一步研究三七皂苷类成分治疗缺血性脑卒中的作用机制提供实验依据,并为三七的临床应用奠定理论基础。方法建立脑中动脉缺血/再灌（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）大鼠脑缺血模型与氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）诱导的细胞模型。NGR1于MCAO手术后立即腹腔注射,连续给药28天。①采用TTC染色法检测NGR1不同给药剂量对大鼠脑梗死体积的影响;②采用免疫学手段（尼氏染色法）评价NGR1不同给药剂量对大鼠皮层和海马神经元形态和活力的影响;③通过多普勒成像、免疫荧光双标、双光子成像、透射电镜、划痕实验、EdU增殖实验和成管实验考察NGR1对血管新生的促进作用;④通过ELISA、基质辅助激光解吸附/电离质谱成像技术（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging,MALDI-MSI）、划痕实验、EdU增殖实验、western blot法分析NGR1促进血管新生的作用机制,并采用烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT）抑制剂 FK866和SIRT1抑制剂Ex-527进一步验证NGR1对缺血性脑卒中血管新生的分子机制。⑤通过行为学实验、免疫荧光双标、western blot、ELISA、MALDI-MSI、划痕实验和EdU增殖实验考察NGR1对修复神经功能和神经发生的促进作用。⑥通过免疫荧光双标、划痕实验、EdU增殖实验、western blot法分析NGR1促进神经发生的作用机制,并采用TrkB抑制剂ANA-12和PI3K抑制剂LY294002进一步验证NGR1对缺血性脑卒中神经发生的分子机制。结果1.与模型组相比,高剂量（40 mg·kg-1）和中剂量（20 mg·kg-1）NGR1治疗给药7天能显着改善大鼠局部脑梗死体积;改善大鼠皮层和海马CA1区尼氏小体丢失情况、提升神经元活力。另外,NGR1中剂量（20 mg·kg-1）对海马CA1区尼氏小体丢失的改善及神经元活力的提升作用更加明显。2.NGR1（20 mg·kg-1）治疗给药28天能够显着恢复脑缺血大鼠的脑血流量、促进新生神经元CD31+/EdU+的增殖、增加血管密度及血管分叉数、增长总血管长度、改善脑微血管内皮细胞结构;显着提高血管生成因子VEGF、TGF-β、b FGF2和PDGF在皮层组织及血清中的表达;显着改善能量代谢因子NAD+、ATP、ADP、AMP和GMP表达水平。体外实验结果表明,12.5～50μM的NGR1孵育处理可显着提高HBMEC脑微血管内皮细胞的迁移、增殖与成管,而NGR1对HBMEC脑微血管内皮细胞迁移和增殖的作用被NAMPT抑制剂FK866和SIRT1抑制剂Ex-527抑制。通过体内外实验进一步发现,NGR1处理可以显着抑制由温度和蛋白酶引起的NAMPT降解,提高NAMPT的表达水平,上调SIRT1表达,SIRT1的上调能够使Notch细胞结构内域NICD脱乙酰化,从而抑制DLL4-Notch信号传导,引起内皮祖细胞中VEGFR-2的上调,从而增强了 EPC血管生成功能,而NGR1促血管生成功能被FK866和Ex-527抑制。另一方面,NGR1（20 mg·kg-1）治疗给药7天处理能够显着提高NAMPT的表达水平,上调NAD+,提高SIRT1/2/3的表达,增加线粒体保护作用,改善能量代谢,而NGR1改善能量代谢作用被FK866抑制。3.NGR1（20 mg·kg-1）治疗给药28天能够显着改善脑缺血大鼠各项行为学指标;促进新生神经元DCX+/EdU+、Nestin+/EdU+和NeuN+/EdU+的增殖;促进少突胶质细胞APC+/EdU+的增殖;提高神经营养因子BDNF、NGF和NT-4在皮层组织及血清中的表达;增加缺血再灌注损伤后突触蛋白SYN、PSD95、MAP-2和Tau-1的表达水平;促进神经递质谷氨酸、N-乙酰天冬氨酸和K+的释放。体外实验结果表明,12.5～100 μM的NGR1孵育处理可显着提高PC12神经元细胞的迁移与增殖,而NGR1对PC12神经元细胞迁移和增殖的作用被TrkB抑制剂ANA-12和PI3K抑制剂LY294002抑制。通过体内外实验进一步发现,NGR1处理能够显着提高BDNF的表达水平,特异性激活其受体TrkB的表达,上调BDNF信号传导下游效应因子CREB和Akt的表达,而NGR1对BDNF/Akt/CREB信号通路的激活被ANA-12和LY294002抑制。结论NGR1（20 mg·kg-1）治疗给药能够显着促进缺血性脑卒中大鼠神经修复,促进血管新生,其作用机制与调控NAMPT/Notch/VEGFR-2信号通路相关。另外,NGR1治疗给药能够显着改善缺血引起的神经功能损伤,促进神经发生,其作用机制与激活BDNF/Akt/CREB信号通路相关。以上发现为三七促进缺血性脑卒中的神经功能修复提供了新的科学依据。
刘婉莹[5]（2020）在《芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中血管新生的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景:中风是一种复杂且威胁生命的疾病,是全球死亡和残疾的主要原因之一。中风的恢复需要一系列神经干细胞和神经血管单元之间精密互动配合,因此在症状出现后尽快恢复缺血区血供成为缺血性中风治疗的首选,但现有治疗手段的效果都不理想,其中药物治疗是脑中风临床治疗的重要途径之一。中医学认为缺血性中风即为中风病的范涛,因经气升降失司、气血运行失常,致气血逆乱而发病,其病因病机虽然复杂,但无非气血二字;而由“气中之血药”川芎及“血中之气药”当归两味药组成的芎归方则为治疗缺血性脑血管病常用方药。本团队前期用芎归方开发的上市中成药舒脑欣滴丸进行了相关研究,表明舒脑欣滴丸有促进缺血性脑损伤大鼠血管新生、神经元再生和脑组织重建的作用。另外,现代医学研究发现干细胞具有治疗卒中的临床潜力,但也存在诸多风险;有研究表明在干细胞发挥主要治疗作用的旁分泌效应中,外泌体（exsomes）占主导地位,并且能避免干细胞治疗的诸多风险,但疗效仍有不足。此外相关研究发现,PI3K/Akt/mTOR信号通路对于促进细胞周期、细胞增殖、血管生成有着至关重要的作用。研究目的:探讨芎归方是否能对微环境进行调控,以提高骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSCs-exosomes）对缺血性脑卒中恢复期血管新生的作用;分析芎归方协同BMSCs-exosomes是否通过mTOR/p70S6K通路协同调控缺血性脑卒中恢复期血管新生。研究方法:1.原代大鼠BMSCs培养及鉴定。分离大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,用含1%双抗和10%胎牛血清的完全培养基培养,运用细胞流式术进行鉴定。2.BMSCs-exosomes的分离鉴定。以超速离心机100,000×g离心12小时的方法去除血清中的exosomes,配制含10%无exosomes血清的培基对BMSCs进行培养,取其上清液进行离心、超速离心以分离获得BMSCs-exosomes,并重悬于1×PBS中,-80°保存。并运用Westernblot检测法和透射电镜观察形态鉴定拍照。3.运用线栓法制作SD大鼠短暂性大脑中动脉闭塞缺血（tMCAO）模型。将实验动物随机分为六组,造模成功后的大鼠分为模型组（tMCAO组）、芎归方组（tMCAO+SNX组）、外泌体组（tMCAO+exos组）、协同组（tMCAO+SNX+exos组）、抑制剂组（tMCAO+SNX+exos+RAPA组）和假手术组（Sham组）,其中芎归方组给予舒脑欣滴丸配成液（溶于生理盐水,每只大鼠按45mg/kg/d灌胃,tMCAO后24h给药并持续七天）,外泌体组予以BMSCs-Exosomes400μg/kg尾静脉注射（tMCAO后24h、3d、5d、7d给药）,协同组按上述方法给予舒脑欣滴丸和BMSCs-exosomes共同干预,抑制剂组则是在给予舒脑欣滴丸和BMSCs-exosomes之前先给予RAPA（每只大鼠按照2mg/kg/d腹腔注射,tMCAO后24h给药并持续七天）,假手术组与模型组给予等体积1×PBS尾静脉注射。造模后第1、3和7天对大鼠进行神经功能缺损评分、足部故障测试、掉线试验。并用激光多普勒脑血流监测仪-DRT4监测大鼠tMCAO后21d脑血流量改变,于饲养21d后心脏灌注取脑,采用HE染色观察各组大鼠脑组织梗死体积。4.运用Westernblot免疫蛋白印迹法检测PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、VEGF等蛋白的表达情况。研究结果:1.各组大鼠神经功能缺损评分结果显示,缺血再灌后第3d,各组mNSS评分均有所降低,与模型组比较,协同组mNSS评分明显降低（P<0.05）;与协同组组相比,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。缺血再灌后第7d,各组mNSS评分显着降低,与模型组比较,协同组mNSS评分显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组比较差异有统计学意义（P<0.05）。2.各组大鼠掉线试验显示,缺血再灌后第3d,与模型组比较,其余各组比较差异均无统计学意义（P>0.05）;与协同组比较,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。缺血再灌后第7d,与模型组比较,各组比较差异均无统计学意义（P>0.05）,与协同组比较,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。3.行足部障碍测试,缺血再灌后第3d,与模型组比较,其余各组评分比较差异无统计学意义（P>0.05）;与协同组相比,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。缺血再灌后第7d足部障碍测试显示,与模型组相比,协同组评分显着下降（P<0.01）;与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组评分明显高于协同组（P<0.05）。4.脑缺血区域脑血流量监测结果显示,与模型组相比,芎归方组、外泌体组、协同组比较差异具有统计学意义（P<0.05）;与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组脑血流量较低（P<0.05）。5.脑梗死体积比较结果显示,与模型组相比,芎归方组、外泌体组、协同组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）;与协同组比较,外泌体组比较差异无统计学意义（P>0.05）,抑制剂组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。6.Westernblot检测结果显示,各组间PI3K、AKT、p70S6K等蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）;与协同组相比,抑制剂组mTOR蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与模型组相比,芎归方组p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）;外泌体组p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）;协同组p-PI3K、p-AKT、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05）,p-mTOR蛋白表达水平升高（P<0.01）。与协同组相比,抑制剂组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平显着降低（P<0.05,P<0.01）;外泌体组p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。研究结论:1.芎归方调控微环境,可能提高BMSCs-exosomes促进缺血性脑卒中恢复期血管新生的作用,改善tMCAO大鼠脑组织损伤和神经功能缺损;2.芎归方与BMSCs-exosomes可以通过PI3K/Akt/mTOR/p70S6通路协同调控tMCAO大鼠的血管新生,促进缺血性脑损伤后大鼠神经功能的修复。
胡艳红[6]（2020）在《益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究》文中认为国际糖尿病联盟数据显示,2019年全球20-79岁成人死亡人数中,因患糖尿病而致死的约占11.3%;65-99岁年龄段人群中,糖尿病患病率约占19.3%（约1.356亿）,预计到2030年,65岁以上（65-99岁）的糖尿病患者人数将达到1.952亿,2045年约2.762亿。这些数据表明糖尿病是全球人口老龄化社会的慢性疾病负担,预防糖尿病及其并发症对延缓衰老与衰老相关性疾病的研究,应对人口老龄化意义重大。流行病学调查研究显示,糖尿病血管病变是糖尿病患者主要常见并发症,与糖尿病血糖波动密切相关,是其他多种并发症发生的病理基础。血管是人体多种器官的重要组成部分,血管衰老是引起人体多器官系统衰老的重要病理生理基础,是血管相关性疾病发生的高危因素,故研究糖尿病血管衰老及其并发症对延缓糖尿病血管病变,提高老年人身体健康刻不容缓。糖尿病血管衰老分糖尿病大血管衰老和糖尿病微血管衰老,其中胸主动脉和颈总动脉是大血管衰老主要损伤部位,胸主动脉和颈总动脉作为心脑的主要供血部位,两血管衰老可进一步加重心肌纤维化、脑认知功能障碍等心脑血管损伤,导致心脑老化。血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC）作为血管壁中膜的主要构成成分,其异常增殖、迁移、细胞周期改变和表型转化,是导致VSMC衰老,加速血管衰老,最终诱导糖尿病血管衰老的重要病理因素。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）通路是影响衰老的主要信号通路,现大量研究发现,AMPK/mTOR通路在糖尿病大血管损伤、糖尿病心脏病、糖尿病脑病、糖尿病肾病及糖尿病视网膜损伤等糖尿病血管病变方面具有重要预防和保护作用,也是影响VSMC增殖、迁移和表型转化的重要途径,可减少VSMC衰老,参与血管衰老进程,并与糖代谢关系密切。因此基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的作用机制意义重大。人参三七川芎提取物（Ginseng Radix et Rhizoma,Notoginseng Radixet Rhizomaand Chuanxiong Rhizomaextracts,GSC）是益气活血药人参、三七、川芎的醇提取物,前期药理学研究显示,GSC具有较好的抗衰老功效,在一定程度上可以从整体、血管组织、细胞和分子水平延缓大鼠生理性血管衰老和复制性血管内皮细胞和VSMC衰老。但对于疾病造成的病理性血管衰老的机制及GSC对此类血管衰老及并发症的干预研究仍处于初步阶段。因此本研究通过构建体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型和体外高糖诱导人主动脉血管平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle Cell,HASMC）衰老模型,观察益气活血药GSC对糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导HASMC衰老的保护作用,并以AMPK抑制剂和基因转染技术抑制HASMC中AMPK表达为切入点,探讨基于AMPK/mTOR通路GSC对高糖诱导HASMC衰老的调节作用和机制。第一部分益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症的体内实验研究实验一益气活血药延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的机制研究目的:探讨GSC对糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的作用机制。方法:腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）联合高脂饲料长期喂养诱导糖尿病小鼠模型,造模7个月后,随机分为空白对照（Control）组、糖尿病（HG）组、GSC-L组、GSC-H组和二甲双胍（Met）组,连续给药9周。取材前购进新一批4周龄雄性C57BL/6小鼠正常适应性喂养7天,作为青年（Young）组。观察各组小鼠一般状态,检测小鼠随机血糖,使用苏木精-伊红（HE）染色、胶原纤维（Masson）染色结合透射电镜（TEM）检测小鼠颈总动脉病理形态学变化,采用冯库萨（Von Kossa）染色检测小鼠颈总动脉、胸主动脉钙盐沉积程度,免疫组化（IHC-P）和蛋白免疫印迹法（WB）检测小鼠颈总动脉和胸主动脉中基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinases 2,MMP-2）、周期蛋白依赖激酶抑制因子2A（p16）、周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A（p21）、runt 相关转录因子-2（Runt-related transcriptionfactor-2,Runx2）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin,α-SMA）与平滑肌 22α 蛋白（Smooth Muscle 22α,SM22α）蛋白表达。结果:Young组和Control组小鼠体型适中、反应灵敏、活泼好动、毛发黑亮有光泽,血糖较低,颈总动脉、胸主动脉病理形态学改变较轻,各衰老蛋白表达较正常;与Control组相比较,HG组小鼠体型瘦弱、反应迟钝、弓背卷体、精神萎靡、毛竖无光泽间杂黄白色毛发,血糖升高显着（P<0.01）。颈总动脉血管纤维化,血管壁内皮细胞和VSMC损伤严重,胞质裂解、突起,胞内空泡和溶酶体等大量增多,中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管病理形态学改变加重（P<0.01）。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达增加,SM22α蛋白表达减少（P<0.01）。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达,α-SMA低表达（P<0.01）;与HG相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠外在衰老状态明显好转,血糖下降显着（P<0.05）,颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度、颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度明显减轻（P<0.01）。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达减少,SM22α蛋白表达增强（P<0.05）。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达被抑制,α-SMA表达增强（P<0.05）。结论:高糖可以通过改变小鼠一般状态,刺激颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管衰老病理形态学变化改变,调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α相关衰老蛋白表达,诱导小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老。GSC可以降低糖尿病小鼠血糖水平,改善小鼠外在衰老状态和体内血管衰老病理性变化,延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老,其作用机制可能是通过调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α蛋白表达来发挥作用。实验二基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠心脏老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠心脏老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显着衰老病理变化,故在检测糖尿病心肌纤维化时只分Control组、HG组、GSC-L组、GSC-H组和Met组五组。其余分组同体内实验一。分别使用HE、Masson、Von Kossa结合TEM检测小鼠心脏组织病理形态学改变,采用IHC-P和WB检测心脏组织中胶原蛋白Ⅰ型（Collagen types I,Collagen I）、胶原蛋白Ⅲ型（Collagen types Ⅲ,Collagen Ⅲ）、转化生长因子 β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）蛋白表达,WB 检测 MMP-2、抑癌基因 p53（Tumor suppressor p53,p53）、磷酸化抑癌基因 p-p53（Phospho-tumor suppressor p53,p-p53）蛋白和 AMPK/mTOR 通路表达。结果:Young和Control组小鼠心肌纤维、心肌细胞排列均匀致密、有规则,结构清晰完整。心脏微血管染色均匀,未见明显钙盐沉积。MMP2、p53、p-p53及AMPK/mTOR通路表达不显着;与Control组相比较,HG组心肌细胞体积增大,核皱缩,线粒体肿胀、变性、线粒体嵴空泡化,甚至断裂。细胞间隙增宽,排列紊乱,多见炎细胞浸润,并可见灶性坏死。心脏微血管正常结构被破坏,血管弹性纤维间有大量棕色钙盐颗粒沉积,心肌间质尤其是在微血管周围有蓝染胶原纤维大量沉积（P<0.01）。心肌中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白高表达,p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK蛋白比值显着降低,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K蛋白比值升高显着（P<0.05）。与HG组相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠心脏组织病理形态学显着改善（P<0.05）,CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白表达水平下降,可有效上调 p-LKB1/LKB1 和 p-AMPK/AMPK 蛋白比值,下调 p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K 蛋白比值（P<0.05）。结论:高糖通过刺激小鼠心脏发生心肌纤维化、心脏超微结构改变、心脏微血管纤维化和钙化等病理形态学改变,增加心肌纤维化标志物Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1和衰老蛋白MMP2、p53和p-p53表达,促进AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,从而诱导心脏老化。GSC能够改善糖尿病小鼠心脏病理形态学变化,延缓心脏老化,其作用机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路表达,抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53和p-p53蛋白表达来发挥作用。实验三基于AMPK-mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠脑老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠脑老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一和实验二显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显着衰老病理变化,故在检测糖尿病小鼠海马区尼氏体数量变化和神经元损伤时,没有检测Young组病理变化。其余分组同体内实验一。使用旷场实验检测小鼠行为学变化,分别使用HE、Nissl、Von Kossa结合TEM检测小鼠脑组织海马区组织病理形态学改变,采用IHC-P检测海马组织晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end-product,AGE）和β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）蛋白表达,WB检测海马组织AGE、糖基化终末产物受体（Receptor of advanced glycation end-products,RAGE）、Aβ、MMP2、p53、p-p53 和AMPK/mTOR通路表达。结果:Young和Control组小鼠行为学、脑微血管病理形态学及超微结构无显着改变,衰老蛋白及AMPK/mTOR通路表达无显着差异;与Control组相比较,HG组小鼠中央活动总时间和总行径路程均显着下降（P<0.01）,脑微血管内细胞数量减少、排列紊乱,可见血管腔狭窄,血管壁有棕色颗粒沉积。神经元核膜皱缩,染色质分布不均匀,电子密度低,胞浆内细胞器部分溶解消失,脑微血管壁结构欠清晰。尼氏体、神经元和锥体细胞数量减少（P<0.01）。海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53的蛋白表达水平显着增加,AMPK/mTOR通路表达存在显着差异（P<0.01）;与HG组相比较,各药物干预组小鼠行为学、脑微血管病理形态学均显着改善,海马CA1、CA3和DG区神经元变性减轻,尼氏体、神经元和锥体细胞数量增加（P<0.01）,海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白活性显着下降,AMPK/mTOR通路表达被改善（P<0.05）。结论:高糖可以诱导小鼠海马区尼氏体数目减少,导致神经元受损及超微结构改变,加速脑微血管钙化等病理改变,增加AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达,促使AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,改变小鼠行为学变化,致使脑老化。GSC可以从行为学方面改善糖尿病小鼠的衰老状态,并通过抑制小鼠海马区尼氏体缺失和神经元损伤,缓解脑微血管钙化和海马区超微结构改变,充分发挥脑保护作用。其保护机制可能是通过调节AMPK/mTOR通路,抑制AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达有关。第二部分益气活血药延缓高糖诱导血管平滑肌细胞衰老的体外实验研究实验一建立高糖诱导的HASMC衰老模型目的:探索一种稳定的高糖诱导的病理性HASMC衰老模型,为研究GSC延缓血管衰老提供一种新的细胞实验模型。方法:取第6或7代HASMC接种贴壁后,用无血清DMEM低糖基础培养基饥饿24h,然后选择5.5、11、22、33、44、66、88和110 mmol/L浓度的高糖培养基分别干预24h、48h、72h、96h,用MTT筛选诱导HASMC衰老的最佳高糖浓度和干预时间。继而依次使用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测细胞衰老程度,划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,流式检测细胞周期,WB检测衰老相关蛋白MMP2、p53、p-p53和表型转化标志蛋白SM22α、α-SMA、Runx2、OPN和重组人骨形态发生蛋白-2（Recombinant Human Bone Morphogenetic protein-2,BMP-2）表达,进一步验证最佳高糖造模浓度和干预时间。结果:MTT结果显示:33 mmol/LD-Glucose干预HASMC 72h时,HG组细胞增殖活力显着下降,D-M组细胞增殖活力变化不明显,确立为诱导HASMC衰老模型最佳高糖浓度和干预时间。与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升（P<0.05）。结论:33 mmol/LD-Glucose培养基作用HASMC72h时,细胞衰老较为明显,为诱导HASMC衰老模型的最佳高糖浓度和最佳作用时间。HASMC衰老机制可能与改变细胞增殖迁移能力、SA-β-gal表达、细胞周期、表型转化,调节p53、p-53、MMP2、SM22α、α-SMA、Runx2、OPN、BMP-2 蛋白表达有关。实验二益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC对高糖诱导的HASMC衰老的影响。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,分别筛选GSC和Met最佳干预浓度,然后分为Control组、HG组、GSC-L组、GSC-M组、GSC-L组和Met组。在体内实验一检测方法的基础上,再使用免疫荧光检测α-SMA和OPN荧光表达。结果:与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比、α-SMA荧光表达及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比、OPN荧光表达及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升（P<0.05）;与HG组相比较,GSC和Met干预组细胞增殖活力和迁移能力增加,细胞SA-β-gal蓝染比率和G0/G1期细胞所占百分比下降,S期上升,衰老蛋白MMP2、p53、p-p53及合成型标志物Runx2、OPN、BMP-2表达受到抑制,收缩型标志物SM22α、α-SMA蛋白表达水平增加（P<0.05）。结论:GSC通过改善HASMC增殖迁移能力、细胞周期、表型转化和β-半乳糖苷酶表达可延缓高糖诱导的HASMC衰老,其干预机制可能与降低MMP2、p53、p-p53、OPN、Runx2、BMP-2表达水平,增加SM22α、α-SMA表达水平密切相关。实验三基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC在HASMC衰老中对AMPK/mTOR信号通路的影响。通过AMPK抑制剂和基因转染技术干扰AMPK活性与表达,进一步探讨GSC延缓HASMC衰老的作用机制。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,基因转染技术干扰AMPK活性分为Control组、HG组、GSC组和Met组,其余分组同体内实验二。WB检测AMPK/mTOR通路活化,AMPK抑制剂Compound C和AMPKα1慢病毒颗粒干扰AMPK活化后,采用体内实验一检测方法进行具体指标检测。结果:1)与Control组相比较,HG组HASMC p-AMPK/AMPK比值下调,p-mTOR/mTOR比值上调（P<0.01）;与HG组相比较,药物干预组p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR比值趋于正常（P<0.05）。2)Compound C抑制AMPK活性后,与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、细胞周期改变、SA-β-gal蓝染比率、表型转化及 MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN 和 BMP-2 蛋白表达和 AMPK/mTOR 通路表达方面尚未有显着差异。3)AMPKα1沉默后,与SCR shRNA阴性对照组比较,AMPKα1 shRNA转染后HASMC中AMPK磷酸化与未磷酸化表达水平下调（P<0.01）,mTOR磷酸化与未磷酸化表达水平上调显着（P<0.01）,HASMC增殖迁移能力及SM22α、α-SMA蛋白表达均下降,MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN和BMP-2蛋白表达上调,部分具有统计学差异（P<0.05,P<0.01）;与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、表型转化及衰老相关蛋白和AMPK/mTOR通路表达尚未有显着差异。结论:AMPK/mTOR通路参与高糖诱导HASMC衰老这一过程,GSC可以调控AMPK/mTOR通路,保护HASMC衰老。通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰AMPK表达后,GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用显着减弱。提示GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用机制,部分可能来源于对AMPK/mTOR通路的调控。综上所述,本研究利用体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型及体外高糖诱导的HASMC衰老模型,证明益气活血药GSC可以延缓糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导的HASMC衰老。并通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰HASMC AMPK表达后,观察GSC对HASMC衰老的作用,进一步证实GSC延缓糖尿病血管衰老及并发症的机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路及其上下游通路来发挥作用的,以往未从此角度探索益气活血药对血管衰老及血管衰老并发症的保护作用,为中医药防治糖尿病心脑血管疾病提供了新思路。
李泽惠[7]（2020）在《参麻益智方调控星形胶质细胞改善VaD大鼠认知功能研究》文中研究表明研究背景:血管性痴呆（vascular dementia,VaD）是指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上产生的以高级神经认知功能障碍为主的一组临床综合征,是患病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的第二常见痴呆类型。VaD发病率随年龄增长,故在人口老龄化趋势下正逐渐成为社会主要健康问题之一。VaD的病理标准尚缺乏明确的共识,其发病机制与氧化应激损伤、神经炎症、脑能量代谢障碍、胆碱能系统失调等有关。尽管在该领域进行了大量的研究工作,但目前可用的治疗方法也只是对症治疗,可在短期内减轻一些认知功能症状,但几乎不能减缓疾病的进展。而中医药具有多靶点、多途径的作用机制,在增强记忆力、控制与痴呆相关的精神和行为症状方面有较多经验,在VaD治疗上也逐步显示出优势。星形胶质细胞（astrocyte,AS）在脑内广泛分布,具有结构支持、信息传递、代谢平衡维持、脑血流量调节等众多功能;神经系统的损伤和病变,都可以使AS表现出形态、功能以及基因表达的反应性改变。越来越多证据显示反应性AS增生也是复杂、多面性的过程,因此,研究VaD模型的AS类型及特化生物学功能,对于AS在VaD疾病过程中可能获得或失去的功能进行探讨,对于阐明VaD的发生、发展及治疗有着十分重要的意义。参麻益智方由人参、天麻、鬼箭羽、川芎组成,具有补虚益智,化瘀通络的功效,是周文泉教授治疗气虚血瘀型血管性痴呆的经验方,对于VaD的早期预防和干预治疗效果显着。本研究在前期研究的基础上,通过观察参麻益智方对AS及其功能的调控作用,以明确其改善VaD大鼠认知功能的机制,为临床应用提供参考依据。目的:观察参麻益智方对血管性痴呆模型大鼠认知功能和星形胶质细胞的影响,并阐明其调控机制。方法:采用微球栓塞法建立VaD大鼠模型,随机分为假手术（Sham）组、微球栓塞模型（ME）组、参麻益智方低剂量（ME+SL）组和参麻益智方高剂量（ME+SH）组,灌胃给药2周。通过Morris水迷宫实验评价大鼠的空间学习记忆能力;免疫荧光法标记脑组织切片NeuN、GFAP并进行阳性细胞（神经元、星形胶质细胞）计数;抗体芯片筛选模型差异神经相关蛋白表达;ELISA检测促炎因子IL-1β和TNF-α的含量;Western blot检测VEGF、HIF-1α的表达情况;qPCR检测Nrf2、HO-1 的 mRNA 水平。结果:1.Morris水迷宫实验结果显示:与Sham组相比,ME组大鼠的逃避潜伏期明显延长（P<0.05）,穿越平台次数明显减少（P<0.05）,目标象限停留时间明显缩短（P<0.05）,提示ME大鼠有空间学习记忆能力的损伤;ME+SH组逃避潜伏期较ME组明显缩短（P<0.05）,ME+SL组和ME+SH组穿越平台次数较ME组明显增多（P<0.05）,ME+SL组和ME+SH组原平台象限停留时间较ME组明显延长（P<0.05）,提示参麻益智方能够改善VaD大鼠的空间学习记忆能力。2.NeuN免疫荧光结果显示:ME组海马CA1区NeuN阳性细胞数量较Sham组明显减少（P<0.05）,提示ME大鼠的海马CA1区神经元受到损伤而丢失;ME+SH组的NeuN 阳性细胞数量较ME组明显增多（P<0.05）,提示参麻益智方能够减少海马CA1区神经元的丢失。3.GFAP免疫荧光结果显示:ME组海马CA1区GFAP阳性细胞数量较Sham组明显增多（P<0.05）,ME+SH组GFAP阳性细胞数量较ME组明显增多（P<0.05）。4.抗体芯片对神经相关蛋白筛选结果显示:ME组TNF-α、IL-1β、IFNγ、VEGFA水平较Sham组明显升高（P<0.05）。5.ELISA结果显示:ME组IL-1β、TNF-α含量较Sham组明显升高（P<0.05）;ME+SL、ME+SH 组 IL-1β、TNF-α 含量均较 ME 组明显降低（P<0.05）。6.Western blot结果显示:ME组VEGF表达较Sham组明显升高（P<0.05）,ME+SH组VEGF表达较ME组明显升高（P<0.05）。ME组HIF-1α表达较Sham组明显升高（P<0.05）,ME+SL、ME+SH组HIF-1α表达较ME组明显升高（P<0.05）。7.qPCR结果显示:ME组HO-1、Nrf2 mRNA水平较Sham组明显升高（P<0.05）;ME+SL、ME+SH 组 HO-1、Nrf2 mRNA 水平较 ME 组明显升高（P<0.05）。结论:参麻益智方可能通过上调Nrf2/HO-1通路,促进星形胶质细胞产生具有保护作用的反应性增生,一方面抑制促炎因子IL-1β、TNF-α的表达减少神经损伤,另一方面通过上调HIF-1α促进神经营养因子VEGF的分泌,发挥神经保护、改善认知功能的作用。
田方泽[8]（2020）在《通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究》文中研究指明缺血性脑卒中是全球高发病率和高死亡率的主要疾病之一。脑水肿是缺血性脑卒中最大的并发症之一,是大面积缺血性脑卒中患者急性期恶化和死亡的主要原因。星形胶质细胞是脑水肿的重要参与细胞,其与脑血管功能变化,与水转运蛋白的活性改变密切相关,且在脑水肿的稳态中起到重要的作用。高迁移率组1（High-mobility group box 1,HMGB1）/Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）通路作为炎性的标志性通路,在缺血性脑卒中早期脑水肿的病程发展中起了十分重要的作用。HMGB1是炎症级联反应的有效诱导物,主要在胶质细胞上表达,引起神经水肿和诱导巨噬细胞合成肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白介素-6（inter-leukin-6,IL-6）、白介素 1β（inter-leukin-β,IL-1β）,导致炎症细胞的聚集和渗透,同时诱发炎症和一系列继发性组织损伤。因此,在缺血性脑水肿的研究中,星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路对AQP4和血脑屏障的影响具有重要的意义。通络清脑方（Tong LuoQingNao,TLQN）是本实验室前期研究用来治疗缺血性脑卒中急性期脑水肿的中药新药,其主要由三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins,PNS）、栀子苷（Geniposide,GE）,黄芩苷（Baicalin,BA）三类有效成分组成,对脑缺血的炎性反应有明显的抑制作用,具有缓解脑水肿,能降低水通道蛋白（Aquaporin-4,AQP4）的表达的作用。本课题研究TLQN及其有效组分对星形胶质细胞HMGB1/TLR4炎性通路对AQP4和血脑屏障影响,从而探寻TLQN抑制缺血性卒中脑水肿的作用机制。第一部分通络清脑方对缺血再灌注大鼠脑水肿及星形胶质HMGB1/TLR4通路和血脑屏障的影响目的:应用大鼠脑缺血再灌注模型,观察TLQN及其有效组分对缺血再灌注大鼠急性期脑水肿的影响和对星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路及血脑屏障的影响。方法:线栓法复制大鼠脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组（Sham）,再灌注组（Cerebralischemia-reperfusion,CIR）,通络清脑方（TLQN）42mg/kg 组（其中黄芩苷:栀子苷:三七总皂苷=1:12:6）,三七总皂苷（PNS）13.3mg/kg组、栀子苷+黄芩苷（BA+GE）26.5mg/kg+2.2mg/kg组,手术当天给药,尾静脉注射给药2d,1次/d。设立再灌注24h、48h为观察期。1.通过体重、神经功能评分、脑干湿重和功能性核磁共振的方法;观察TLQN对脑缺血再灌注大鼠急性期脑水肿的影响;2.采用生化法检测CIR大鼠脑缺血侧皮层和血液中IL-6,IL-1β,TNF-α浓度含量;3.采用Western Blot和免疫荧光的方法,检测TLQN及其有效组分对缺血再灌注大鼠24h,48h皮层AQP4、HMGB1、TLR4、NF-κB、p-NF-κB表达及蛋白水平的变化。4.采用透射电镜和免疫组化的方法,检测TLQN及有效组分对缺血再灌注大鼠细胞肿胀及血脑屏障的影响。结果:1.体重和神经功能评分结果显示,再灌注大鼠出现明显的神经功能缺损症状,TLQN组大鼠神经功能缺损评分在24h,48h明显降低（P<0.05）,PNS组和BA+GE组在48h大鼠神经功能缺损评分出现明显降低（P<0.05）。2.脑含水量结果显示:与Sham组相比,缺血再灌注24 h大鼠,脑含水量明显增加（P<0.05）;TLQN组大鼠24 h后脑含水量明显降低（P<0.05）;再灌注48 h后,TLQN、BA+GE组和PNS组脑含水量明显降低（P<0.05）。核磁共振结果显示:再灌注24h后CIR大鼠大脑海马、胼胝体和前皮层三个区域ADC信号明显降低（P<0.01）,TLQN组、PNS组和BA+GE组大鼠前皮层和胼胝体ADC明显高于CIR组（P<0.05）,而海马区域有上升趋势（P>0.05）。3.生化检测显示,CIR组大鼠缺血侧大脑皮层IL-6,IL-1β,TNF-α明显上升（P<0.01）;分别给予TLQN、PNS、BA+GE,24h和48h干预后,大鼠缺血侧大脑皮层IL-6,IL-1β,TNF-α明显下降（P<0.05）4.免疫荧光结果与Western-Blots相似,与Sham组相比,CIR组大鼠缺血侧大脑皮层AQP4浓度明显升高（P<0.01）,GFAP激活（P<0.01）,并且HMGB1、TLR4、p-NF-κB也明显上升（P<0.01）;分别给予TLQN、PNS、BA+GE,24h和48h干预后,大鼠缺血侧大脑皮层AQP4浓度显着降低（P<0.05）;GFAP明显收到抑制（P<0.05）,HMGB1、TLR4、p-NF-κB 含量也明显下调（P<0.05）5.透射电镜、GFAP的周长、和免疫组化Claudin-5的检测中显示,TLQN、PNS和BA+GE对缺血再灌注大鼠内皮细胞星形胶质细胞肿胀有明显的缓解作用,并且能够改善血脑屏障的紧密连接使其屏障功能得以修复。第二部分通络清脑方及其有效成分对氧糖剥夺/再复氧（Oxygen-glucose deprivation/Reperfusion,OGD/R）星形胶质细胞神经炎症及HMGB1/TLR4通路的影响目的:应用离体培养人脑星形胶质细胞与星形胶质细胞/微血管内皮细胞共培养实验方法,观察TLQN及单体对OGD/R损伤星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路及内皮细胞紧密连接的影响。方法:1.使用正常的星形胶质细胞检测TLQN及其各有效成分（PNS、BA、GE）的药物毒性浓度,以备后续的药效实验做基础。采用CCK-8法检测星形胶质细胞活力,观察细胞形态。2.构建OGD/R细胞模型,氧糖剥夺6h/复氧复糖12h（OGD/R6/12）,星形胶质细胞分为正常（Control）组和OGD/R组,药物组（TLQN、PNS、BA、GE）分别在2.5～50 μg/ml进行干预,探索TLQN及单体对OGD/R损伤的星形胶质细胞的药效及给药浓度。采用CCK-8法检测星形胶质细胞活力,观察细胞形态。3.采用生化法检测细胞培养有液IL-6,IL-1β,TNF-α的含量;Western Blot、免疫细胞荧光法检测细胞GFAP、AQP4、HMGB1、TLR4、p-NF-κB表达的变化。4.采用免疫荧光和透射电镜技术,在HA/BMECs共培养体系中发现,检测OGD/R后HA细胞的培养液可降低BMECs细胞的存活率,降低细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1和影响细胞内部的影响。结果:1.通过药物毒性结合药效学实验可以看出,TLQN及其有效成分PNS、BA、GE在2.5～50μg/ml浓度内无明显毒性。2.与 OGD/R 后的 HA 细胞对比,TLQN（5μg/mL）和 PNS（10 μg/mL）干预后,细胞活力明显增强（P<0.05）且作用最佳,能够明显改善细胞状态。3.免疫荧光结果与Western-Blots结果相似:1)与Control组相比,OGD/R组HA细胞AQP4浓度明显升高（P<0.01）,,并且HMGB1、TLR4、p-NF-KB也明显上升（P<0.01）;给予 TLQN（5mg/kg）和 PNS（10mg/kg）干预后,HA 细胞 AQP4 浓度显着降低（P<0.05）;HMGB1、TLR4、p-NF-κB含量也明显下调（P<0.01）,且加入丙酮酸乙酯（EP）后,抑制了 OGD/R 组 HA 细胞 AQP4、HMGB1、TLR4、p-NF-κB 的表达。4.CCK8结果显示,GD/R后HA细胞外液对BMECs的存活率有显着的降低（P<0.05）;免疫荧光结果显示,BMECs细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1有明显的下降。在TLQN和PNS干预之后,BMECs的存活率上升,细胞间的Claudin-5、ZO-1的数量增加,上述结果与EP干预后的结果有一致的趋势,表明TLQN具有通过星形胶质细胞抑制内皮细胞损伤的功能。结论:通过体内和体外实验研究表明,基于“神经血管单元”理论,通络清脑可以减轻缺血再灌注大鼠急性期脑水肿,尤其是皮层水肿的作用。其机制是通过星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路抑制AQP4表达和星形胶质细胞肿胀,同时减少水肿相关炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,;通络清脑方通过星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路增加内皮细胞的紧密连接程度,改善血脑屏障功能。其作用的有效组分是活血组（三七总皂苷）。
李韵歆[9]（2020）在《复方当归注射液对脑缺血损伤大鼠MMP-2/9以及拟缺血损伤神经元的影响》文中研究说明缺血性中风是现代医学研究中的一个重大难题,由包括血管阻塞在内的多种原因而造成脑缺血损伤。复方当归注射液（Compound angelica injection,CAI）由当归、川芎、红花三味中药提炼而成,具有良好的活血通络之功。前期研究发现CAI对脑缺血损伤模型具有一定的治疗作用。神经血管单元（Neurovascularunit,NVU）概念的提出扩大了脑缺血损伤研究的视野。血脑屏障（Blood-brainbarrier,BBB）和神经元都是NVU的重要组成部分,也是脑缺血损伤研究中的重要靶点。本研究将以课题组前期的实验结果为基础,从神经血管单元出发,研究CAI对脑缺血损伤的影响。目的:通过建立大鼠永久性大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,研究CAI干预后对大鼠神经行为学、病理形态学以及与BBB关系密切的基质金属蛋白酶（Matrix metal protein,MMP）-2和MMP-9表达的影响;利用CAI作用脑微血管内皮细胞（Brainmicrovascularendothelial cells,BMECs）后的条件培养液干预神经元,探究CAI对神经元拟缺血损伤模型的作用及可能的分子机制。方法:（1）MCAO大鼠行为学及形态学观察:SD大鼠随机分出假手术组（生理盐水3mL/kg）,其余建立大鼠右侧MCAO脑缺血模型。采用Z.Longa5级评分法将造模大鼠平均分成模型组（生理盐水3mL/kg）、阳性对照组（依达拉奉注射液3mL/kg）、CAI组（CAI 10 mL/kg）,在干预1d、3d、7 d、14 d后再次评分,评价CAI对脑缺血损伤大鼠神经功能行为学的影响;用苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色法观察各组大鼠脑组织病理形态学变化。（2）采用免疫组化法分析各组大鼠大脑缺血区皮层组织中MMP-2和MMP-9的表达。（3）原代培养BMECs传至第三代,采用CD31相关抗原进行免疫荧光鉴定;将BMECs 分为正常组、模型组和 CAI 低（1.25 μL/mL）、中（2.5 μL/mL）、高（5μL/mL）剂量组。模型组和CAI组采用氧糖剥夺（Oxygen and glucose deprivation,OGD）法建立BMECs拟缺血损伤模型。收集BMECs正常组的条件培养液（Normal-Conditioned medium,N-CM）、拟缺血模型组的条件培养液（Ischemic-Conditionedmedium,I-CM）及不同剂量CAI组拟缺血损伤后的条件培养液（Ischemic CAI-Conditioned medium,IC-CM）,其中,1.25 γL/mLCAI 作用 BMECs 的 IC-CM 作为 IC-CML,2.5 μL/mL CAI 作用的 IC-CM作为IC-CMM,5μL/mLCAI作用的IC-CM作为IC-CMH;原代培养神经元,采用NSE相关抗原对神经元进行免疫荧光鉴定;将神经元分为5组（N-CM、I-CM、IC-CML、IC-CMM、IC-CMH组）,分别将对应的内皮细胞条件液作用神经元,除N-CM组,其余组均用OGD造模6 h,之后通过CCK-8检测各组神经元的活性。（4）神经元PI3K/Akt和MAPK/Erk通路的相关指标检测:采用PCR法检测各组神经元Akt mRNA的表达水平,采用Western blot法检测各组神经元Akt的磷酸化水平（p-Akt/Akt）和 Erk 的磷酸化水平（p-Erk/Erk）。结果:（1）模型组大鼠的神经功能损伤逐渐加重,第7d时最为严重,CAI干预后可减轻大鼠的神经功能损伤,在7 d、14 d时,CAI组同模型组相比较,差异有统计学意义。HE染色结果显示,各时间点模型组的脑组织均呈现明显的损伤性变化,坏死明显。而阳性对照组和CAI组在干预7 d、14d后,对比模型组有较明显改善。（2）脑缺血时,缺血区皮层MMP-2随着缺血时间的增加而表达逐渐增多,在4个时间点中的表达以7d为峰值,到了 14d时表达减少;相较于模型组,CAI药物干预可降低MMP-2的表达,并在3 d、7 d时差异有统计学意义。MMP-9的高表达出现在早期,在1d时最高,3d、7 d都有所下降,14 d有上升趋势,CAI组相较于模型组1d、3d的表达降低,差异具有统计学意义。（3）OGD造模后,I-CM组神经元活性相较于N-CM组显着降低,CAI干预后的IC-CM组神经元活性随着药物浓度增加而逐渐升高。（4）与N-CM组相比,I-CM组神经元Akt mRNA表达显着减少,各IC-CM组神经元的Akt mRNA表达随着药物浓度增加均呈逐渐升高趋势,其中IC-CMH组的Akt mRNA同I-CM组比较差异有统计学意义;神经元的p-Akt/Akt同Akt的mRNA表达结果的趋势相似,同I-CM组比较,IC-CML组差异有统计学意义,IC-CMM和IC-CMH组差异显着。与N-CM组相比,I-CM组神经元p-Erk/Erk显着升高,CAI干预后的各IC-CM组有出现降低趋势,但相较于I-CM组统计均无差异。结论:CAI可改善模型大鼠神经功能和病理损伤,其作用可能与调控脑缺血损伤大鼠皮层与BBB有关的MMP-2和MMP-9表达有关;CAI作用的BMECs条件液活化神经元PI3K/Akt信号通路提高了拟缺血神经元的存活率。
姚德祎[10]（2020）在《中风醒脑液防治急性脑缺血-再灌注损伤作用及其机制的研究》文中指出研究目的:本研究旨在验证中风醒脑液（ZFXNL）对急性脑缺血-再灌注损伤的防治作用,并筛选出ZFXNL的最佳治疗剂量;进一步探究在急性脑缺血-再灌注过程中ZFXNL对BBB的保护作用及相关机制。为拓展ZFXNL的临床使用范围提供理论依据。研究方法:将114只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为6个组:假手术组、模型组（MCAO-R）、ZFXNL高剂量组（26.46g/Kg/d）、ZFXNL中剂量组（13.23/Kg/d）、ZFXNL低剂量组（6.615/Kg/d）、依达拉奉组（4mg/Kg/d）,其中假手术组14只,其余各组每组20只。造模前6天,ZFXNL组灌胃ZFXNL,每天一次,持续7天,最后一次灌胃在造模前2h。（1）采用线栓法制备右侧大脑中动脉阻塞（MCAO）模型,阻塞1.5h后拔出线栓,形成右侧大脑中动脉缺血-再灌注（MCAO-R）模型,再灌注48h后取材并记录下各组大鼠造模前及取材前体重减轻的百分比,采用longa五分法、本位反射试验、前肢放置试验、提尾试验综合评价大鼠的神经功能。（2）在取材前对大鼠进行心脏灌流,采用苏木精-伊红染色法对脑组织进行染色,利用图形分析软件计算梗死灶面积占比和患侧脑半球肿胀百分比;在光镜下观察缺血半暗带区的病理改变。（3）通过检测脑组织伊文思蓝的漏出量评价血脑屏障的通透性;利用透射电镜观察缺血半暗带区BBB的结构的完整程度;从而评价ZFXNL对BBB的保护作用。（4）采用免疫组化法联合积分光密度法检测紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin和基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9在缺血半暗带区的表达位置和表达量,进而明确ZFXNL在脑I/R过程中保护BBB的机制。实验结果:与模型组相较:（1）ZFXNL高、中剂量组能显着改善MCAO-R大鼠神经功能、缩小脑梗死灶面积、抑制患侧脑半球肿胀、改善缺血半暗带区的病理改变体现其对CI-RI的防治作用（P<0.05）。（2）高、中剂量的ZFXNL能显着减少伊文思蓝的漏出量（P<0.05）、保护血脑屏障中TJ的完整性起到保护血脑屏障的作用。（3）高、中剂量的ZFXNL能明显上调缺血半暗带区血管内皮细胞上Claudin-5、Occludin的表达量（P<0.05）;同时抑制神经元、神经胶质细胞中MMP-2、MMP-9的表达量（P<0.05）。（4）ZFXNL高剂量组出现严重腹泻,体重减轻明显（P<0.05）;ZFXNL高、中剂量组治疗效果和依达拉奉相当（P>0.05）。结论:（1）ZFXNL能够有效防治CI-RI,起到保护缺血半暗带区神经元,改善神经功能,缩小梗死灶面积,抑制脑半球肿胀的作用。（2）ZFXNL能有效保护BBB结构的完整性,维持BBB功能的稳定,进而在结构和功能两个方面起到保护BBB的作用。（3）ZFXNL通过上调缺血半暗带区血管内皮细胞上Claudin-5、Occludin的表达量,抑制神经元、神经胶质细胞中MMP-2、MMP-9的表达量起到保护BBB的作用机制。（4）中剂量（13.23/Kg/d）是ZFXNL保护BBB防治CI-RI的最佳治疗剂量。
二、EFFECTS OF TOTAL SAPONINS OF PANAX NOTOGINSENG AND LIGUSTRAZINE ON THE PROLIFERATION OF CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS OF RATS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EFFECTS OF TOTAL SAPONINS OF PANAX NOTOGINSENG AND LIGUSTRAZINE ON THE PROLIFERATION OF CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS OF RATS（论文提纲范文）
（1）降香及替代药材对HMWD导致的微循环障碍的影响和其主治相关疾病作用机制的网络药理学探讨（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一部分:降香及其替代药材抗高分子右旋糖酐导致的微循环障碍比较研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 实验造模及给药 |
| 2.3 一般观察 |
| 2.4 小鼠耳廓微循环检测 |
| 2.5 大鼠肠系膜相关指标的检测 |
| 2.6 大鼠血流动力学相关指标检查 |
| 2.7 大鼠血液流变学相关指标检查 |
| 2.8 大鼠肺组织出血观察及评分 |
| 2.9 大鼠血清中血管扩张及收缩相关因子及纤溶系统指标检测 |
| 2.10 大鼠血清中脏器损伤指标检测 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 一般观察结果 |
| 3.2 大鼠一般状况观察 |
| 3.3 大鼠肺脏组织出血观察及评分 |
| 3.4 血液流变学指标变化 |
| 3.5 微血管直径变化 |
| 3.6 .微血管红细胞流速变化 |
| 3.7 大鼠左颈动脉压的变化 |
| 3.8 大鼠心电的变化 |
| 3.9 血清中血管扩张及收缩相关因子及纤溶系统指标检测 |
| 3.10 大鼠血清中脏器损伤指标检测 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:基于网络药理学探讨降香功能主治相关疾病的作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 降香活性成分和靶点的获取 |
| 1.2 降香靶点Metascape分析和疾病靶点的获取 |
| 1.3 靶点Venn图和降香活性成分-靶点-疾病网络图构建 |
| 1.4 靶点蛋白互作(PPI)网络的构建 |
| 1.5 靶点的GO生物功能和KEGG通路的富集分析 |
| 1.6 分子对接验证 |
| 2.0 分析结果 |
| 2.1 降香靶点的收集和Metascape分析 |
| 2.2 疾病靶点的获取 |
| 2.3 靶点Venn图和降香活性成分-靶点-疾病网络图 |
| 2.4 共同靶点蛋白互作(PPI)网络 |
| 2.5 共同靶点的GO生物功能和KEGG通路富集分析 |
| 2.6 分子对接 |
| 2.7 CASP3、HMOX1、PPARG在人体不同组织和细胞的特异性表达 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 期望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（2）血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 三七、三七总皂苷各成分对脑卒中的研究进展 |
| 1 中药三七和其成分的研究 |
| 2 三七总皂苷及其各成分对脑卒中的研究进展 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 LINGO-1及其下游信号通路在缺血性脑卒中后神经再生的机制研究 |
| 1 LINGO-1 |
| 2 EGFR |
| 3 PI3K//AKT |
| 4 PTEN |
| 5 GSK-3β |
| 6 PTE、AKT以及GSK-3β的关系 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 实验一 大鼠MCAO模型的建立和评价 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 血塞通对MCAO大鼠术后28天LINGO-1,EGFR以及下游PI3K/AKT通路的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 血塞通对MCAO大鼠术后28天PTEN和GSK-3β的作用 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞实验研究 |
| 实验四 血塞通对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 mNSS神经功能评分表 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（3）冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文索引 |
| 前言 |
| 第一部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠行为学及病理形态学的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量确定及药物配制 |
| 1.3 试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MCAO模型的评价 |
| 2.2 Bederson神经功能评分比较 |
| 2.3 Garcia JH神经功能评分比较 |
| 2.4 脑梗死体积的比较 |
| 2.5 脑组织病理形态的比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验模型及动物的选择 |
| 3.2 中医对缺血性脑卒中的认识及中药治疗 |
| 4 小结 |
| 第二部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠神经血管单元特异性结构蛋白及其结构完整性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NeuN表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Laminin表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区GFAP表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后 脑缺血皮质区EBA表 达的影响 |
| 2.5 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NVU的主要组分结构关系的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Neu N、 EBA和Laminin及 GFAP表达的影响 |
| 3.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NVU主要组分的结构关系的影响 |
| 4 小结 |
| 第三部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠神经血管单元主要组分相关功能蛋白的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区αII-Spectrin表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区AQP-4表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区VEGF表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区MMP-9 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区αII-Spectrin、AQP-4、MMP-9及VEGF表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第四部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠损伤局部Notch信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Notch1表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NICD表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Hes1 表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区DLL4 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Notchl、NICD、Hesl及 DLL4 表达的影响 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 个人简历 |
| 文献综述 |
| 文献综述一 基于神经血管单元的缺血性脑卒中相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 黄芪、三七及冰片抗脑缺血的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）三七皂苷R1对缺血性脑卒中的神经修复作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 NGR1对MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤治疗作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型的建立 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.3 激光多普勒血流仪监测大鼠脑血流量 |
| 2.4 TTC染色检测大鼠脑梗死体积 |
| 2.5 尼氏染色检测大鼠尼氏小体形态 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对MCAO/R大鼠脑血流量的影响 |
| 3.2 NGR1对MCAO/R大鼠脑梗死体积的影响 |
| 3.3 NGR1对MCAO/R大鼠尼氏小体的影响 |
| 本章总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 NGR1对缺血性脑卒中血管新生的药效作用及机制研究 |
| 第一节 NGR1对MCAO/R大鼠脑血管新生的促进作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型的建立 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.3 免疫荧光染色检测大鼠脑新生血管数量 |
| 2.4 双光子成像技术检测大鼠脑血管密度、总血管长度及血管分叉数 |
| 2.5 透射电镜检测大鼠脑微血管内皮细胞结构 |
| 2.6 动物组织样本处理 |
| 2.7 BCA定量 |
| 2.8 ELISA法检测MCAO/R大鼠血清及皮层组织中血管生成因子的表达 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对MCAO/R大鼠脑新生血管数量的影响 |
| 3.2 NGR1对MCAO/R大鼠脑血管密度、总血管长度及血管分叉数的影响 |
| 3.3 NGR1对MCAO/R大鼠脑微血管内皮细胞结构的影响 |
| 3.4 NGR1对MCAO/R大鼠血清及皮层组织中血管生成因子的影响 |
| 实验小结 |
| 第二节 基于MALDI-MSI技术探讨NGR1对MCAO/R大鼠皮层组织中能量代谢因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型的建立 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.3 MALDI-MSI技术检测MCAO/R大鼠脑皮层区ATP、ADP、AMP和GMP的表达 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对MCAO/R大鼠脑皮层区能量代谢因子表达的影响 |
| 实验小结 |
| 第三节 基于NAMPT/Notch/VEGFR-2通路探讨NGR1调控能量代谢促大鼠血管新生的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型的建立 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.3 ELISA法检测MCAO/R大鼠皮层组织中NAD+的表达 |
| 2.4 Western blot检测MCAO/R大鼠皮层组织中NAMPT、SIRT1/2/3、VEGFR-2、NICD、DLIA、Hes1和Hey1的表达 |
| 2.5 免疫组化检测MCAO/R大鼠皮层组织中VEGF的数量 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对MCAO/R大鼠NAMPT-NAD~+-SIRT信号通路的影响 |
| 3.2 NGR1对MCAO/R大鼠皮层VEGFR-2蛋白和Notch信号通路的影响 |
| 实验小结 |
| 第四节 NGR1对HBMEC细胞迁移和OGD/R诱导的HBMEC细胞增殖、成管的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 OGD/R模型建立与分组给药 |
| 2.3 划痕实验检测HBMEC细胞迁移 |
| 2.4 EdU染色法检测OGD/R诱导的HBMEC细胞增殖 |
| 2.5 成管实验检测OGD/R诱导的HBMEC细胞成管 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对HBMEC细胞迁移的影响 |
| 3.2 NGR1对OGD/R诱导的HBMEC细胞增殖的影响 |
| 3.3 NGR1对OGDR诱导的HBMEC细胞成管的影响 |
| 实验小结 |
| 第五节 NGR1促HBMEC细胞迁移与OGD/R诱导的HBMEC细胞增殖分子靶点的验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞裂解液制备 |
| 2.3 Western blot检测HBMEC细胞中NAMPT的表达 |
| 2.4 CETSA法验证靶标蛋白NAMPT |
| 2.5 DARTS法验证靶标蛋白NAMPT |
| 2.6 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对OGD/R诱导的HBMEC细胞NAMPT蛋白的影响 |
| 3.2 NGR1对HBMEC细胞由温度和蛋白酶引起的NAMPT降解的影响 |
| 实验小结 |
| 第六节 NAMPT抑制剂FK866干预验证NGR1调控NAMPT促进HBMEC细胞迁与增殖的分子机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 OGD/R模型建立与分组给药 |
| 2.3 CCK-8检测细胞活力 |
| 2.4 Mito-Tracker CMXRos检测OGD/R诱导的HBMEC细胞线粒体活力 |
| 2.5 细胞裂解液的制备 |
| 2.6 ELISA检测HBMEC细胞中ATP、ATPnase和NAD~+的表达 |
| 2.7 Western blot检测HBMEC细胞中NAMPT、SIRT1、VEGFR-2、NICD、DLL4、Hes1和Hey1的表达 |
| 2.8 划痕实验检测HBMEC细胞迁移 |
| 2.9 EdU染色法检测OGD/R诱导的HBMEC细胞增殖 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 FK866和SIRT1抑制剂Ex-527对HBMEC细胞活力的影响 |
| 3.2 FK866对NGR1促OGD/R诱导的HBMEC细胞线粒体损伤的影响 |
| 3.3 FK866对NGR1促OGD/R诱导的HBMEC细胞内能量代谢水平的影响 |
| 3.4 FK866对NGR1促OGD/R诱导的HBMEC细胞NAMPT-NAD~+-SIRT1信号通路的影响 |
| 3.5 FK866和Ex-527对NGR1促HBMEC细胞迁移的影响 |
| 3.6 FK866和Ex-527对NGR1促OGD/R诱导的HBMEC细胞增殖的影响 |
| 3.7 FK866和Ex-527对NGR1促OGD/R诱导的HBMEC细胞VEGFR-2蛋白和Notch信号通路的影响 |
| 实验小结 |
| 本章总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 NGR1对缺血性脑卒中神经再生的药效作用及机制研究 |
| 第一节 NGR1对MCAO/R大鼠脑神经再生的促进作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型的建立 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.3 神经学评分检测MCAO/R大鼠神经功能损伤 |
| 2.4 圆桶实验检测MCAO/R大鼠前肢运动功能 |
| 2.5 新物体识别实验检测MCAO/R大鼠神经记忆功能 |
| 2.6 免疫荧光检测MCAO/R大鼠新生神经元及成熟少突胶质细胞的生成 |
| 2.7 Western blot检测MCAO/R大鼠皮层组织中未成熟少突胶质细胞的表达 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对MCAO/R大鼠长期神经功能损伤的影响 |
| 3.2 NGR1对MCAO/R大鼠脑新生神经元的影响 |
| 3.3 NGR1对MCAO/R大鼠少突胶质细胞的影响 |
| 实验小结 |
| 第二节 基于BDNF/Akt/CREB通路探讨NGR1促大鼠脑神经再生的分子机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 试剂材料 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型的建立 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.3 动物组织样品处理 |
| 2.4 ELISA检测MCAO/R大鼠血清及皮层组织中神经营养因子的表达 |
| 2.5 MALDI-MSI技术检测MCAO/R大鼠皮层组织中神经递质表达水平 |
| 2.6 Western blot检测MCAO/R大鼠皮层组织中SYP、PSD95、MAP-2、Tau-1、BDNF、TrkB、CREB和AKT的表达水平 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对MCAO/R大鼠血清及皮层组织中神经营养因子表达的影响 |
| 3.2 NGR1对MCAO/R大鼠皮层组织中神经突触蛋白的影响 |
| 3.3 NGR1对MCAO/R大鼠皮层组织中神经递质的影响 |
| 3.4 NGR1对MCAO/R大鼠BDNF/Akt/CREB通路的影响 |
| 实验小结 |
| 第三节 NGR1对PC12细胞迁移与OGD/R诱导的PC12细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 OGD/R模型建立与分组给药 |
| 2.3 划痕实验检测PC12细胞迁移 |
| 2.4 EdU染色法检测OGD/R诱导的PC12细胞增殖 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NGR1对PC12细胞迁移的影响 |
| 3.2 NGR1对OGD/R诱导的PC12细胞增殖的影响 |
| 实验小结 |
| 第四节 TrkB抑制剂 ANA-12和PI3K抑制剂LY294002验证NGR1调控BDNF/Akt/CREB通路促进PC12细胞迁移与增殖的分子机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 OGD/R模型建立与分组给药 |
| 2.3 划痕实验检测PC12细胞迁移 |
| 2.4 EdU染色法检测OGD/R诱导的PC12细胞增殖 |
| 2.5 细胞裂解液的制备 |
| 2.6 Western blot检测OGD/R诱导的PC12细胞BDNF/Akt/CREB信号通路蛋白的表达 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ANA-12和LY294002对NGR1促PC12细胞迁移的影响 |
| 3.2 ANA-12和LY294002对NGR1促OGD/R诱导的PC12细胞增殖的影响 |
| 3.3 ANA-12和LY294002对NGR1促OGD/R诱导的PC12细胞BDNF/Akt/CREB通路的影响 |
| 实验小结 |
| 本章总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 创新与特色 |
| 综述 中药治疗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及研究成果 |
| 致谢 |
（5）芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中血管新生的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 缺血性中风中医演变认识及气血论治理论 |
| 1、缺血性中风中医概念演变史 |
| 1.1 《黄帝内经》时期—始于症状 |
| 1.2 汉代时期—始见《金贵要略》 |
| 1.3 唐宋时期—奠定基础 |
| 1.4 金元时期—重视内因 |
| 1.5 清末时期—中西汇通 |
| 2、缺血性中风中医病因病机演变史 |
| 2.1 金元以前—外风立论 |
| 2.2 金元时期—内风立论 |
| 2.3 明清时期至近现代—内虚邪中 |
| 3、从气血论治缺血性中风理论 |
| 3.1 “气”与“血”在缺血性中风中的地位 |
| 3.2 气血理论下的缺血性中风瘀毒病机 |
| 3.3 气血理论下的缺血性中风痰浊病机 |
| 3.4 气血理论下的缺血性中风风火之邪 |
| 4、气血理论指导下缺血性中风的辨治策略 |
| 4.1 急性期—首辨虚实,紧守病机急性期 |
| 4.2 恢复期及后遗症期—气血通调,防病传变恢复期及后遗症期 |
| 5、小结 |
| 第二部分 芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中大鼠血管新生的效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三部分 芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中大鼠血管新生的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1 中医对缺血性中风的认识 |
| 2 芎归方运用于中风治疗 |
| 3 MSCs和 MSCs-exos运用于中风治疗 |
| 4 芎归方调控微环境以提高BMSCs-exosomes促进缺血性脑卒中大鼠脑血管新生作用 |
| 5 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路与血管新生 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 中医药对脑梗死后血管新生的作用 |
| 参考文献 |
| 综述二 脑卒中疾病中的生物标志物—外泌体 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 AMPK/mTOR通路在糖尿病血管病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 益气活血药人参三七川芎对血管保护作用的药理研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症的体内实验研究 |
| 实验一 益气活血药延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠心脏老化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK-mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠脑老化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益气活血药延缓高糖诱导血管平滑肌细胞衰老的体外实验研究 |
| 实验一 建立高糖诱导的HASMC衰老模型 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）参麻益智方调控星形胶质细胞改善VaD大鼠认知功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一: 星形胶质细胞与脑缺血损伤修复的研究进展 |
| 综述二: 中药调控星形胶质细胞治疗血管性认知功能障碍的研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一: 参麻益智方对VaD大鼠认知功能和神经元损伤的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 参麻益智方对VaD大鼠学习记忆能力的影响 |
| 3.2 参麻益智方对VaD大鼠神经元的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二: 参麻益智方对VaD大鼠反应性星形胶质细胞的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验三: 参麻益智方调控星形胶质细胞的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 VaD大鼠神经相关差异蛋白筛选 |
| 3.2 参麻益智方对IL-1β、TNF-α的影响 |
| 3.3 参麻益智方对HIF-1α、VEGF的影响 |
| 3.4 参麻益智方对Nrf2、HO-1的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 高迁移率组1(HMGB1)在缺血性中风及其相关疾病研究进展 |
| References |
| 综述二 星形胶质细胞维持大脑中水平衡的作用 |
| References |
| 综述三 神经血管单元在缺血性脑水肿中作用机制和中药对其治疗的研究进展 |
| References |
| 前言 |
| 第一部分 通络清脑方对缺血再灌注大鼠皮层脑水肿及星形胶质HMGB1/TLR4通路和血脑屏障的影响 |
| 第一节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠急性期水肿的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠24h星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠48h星形胶质细胞HMGB1/TLR4通路研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第四节 通络清脑方对缺血再灌注大鼠血脑屏障保护作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 通络清脑方及其有效成分对OGD/R星形胶质细胞神经炎症及HMGB1/TLR4通路的影响 |
| 第一节 通络清脑方及其有效成分对OGD/R损伤的星形胶质细胞的保护作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二节 抑制HMGB1后,TLQN和PNS对OGD/R损伤HA细胞HMGB1/TLR4/NF-κB通路及水肿相关炎性相关因子的作用机制研究 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第三节 抑制HMGB1后,TLQN和PNS对OGD/R损伤HA和BMECs细胞共培养紧密连接的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论与小结 |
| 第二部分 小结 |
| 结语 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 通络醒脑方主要成分的含量测定 |
（9）复方当归注射液对脑缺血损伤大鼠MMP-2/9以及拟缺血损伤神经元的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词 |
| 综述一 缺血性中风神经血管单元的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 活血通络方药治疗缺血性中风的药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 实验一 复方当归注射液对脑缺血损伤大鼠行为学以及脑组织形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 复方当归注射液对脑缺血损伤大鼠大脑皮质MMP-2、MMP-9表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 复方当归注射液作用的内皮细胞条件液对拟缺血损伤神经元存活率的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 复方当归注射液作用的内皮细胞条件液对拟缺血损伤神经元PI3K/Akt、MAPK/Erk通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）中风醒脑液防治急性脑缺血-再灌注损伤作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写索引 |
| 引言 |
| 研究路径 |
| 第一部分 中风醒脑液对急性脑缺血-再灌注损伤防治作用的研究 |
| 1.实验材料与设备 |
| 2.研究方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论Ⅰ:实验设计的相关依据 |
| 5.讨论Ⅱ:中风醒脑液对急性脑缺血-再灌注损伤的防治作用 |
| 6.小结 |
| 第二部分 中风醒脑液对脑缺血-再灌注过程中血脑屏障的保护作用及机制的研究 |
| 1.实验材料与设备 |
| 2.研究方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论Ⅰ:中风醒脑液对血脑屏障的保护作用 |
| 5.讨论Ⅱ:中风醒脑液对缺血再灌注区CLAUDIN-5、OCCLUDIN、MMP-2、MMP-9 的调节作用 |
| 6.讨论Ⅲ:中医学对急性脑缺血-再灌注损伤的认识 |
| 7.小结 |
| 全文总结 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 中医药防治脑缺-再灌注损伤的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间公开发表论文及参与科研项目 |
四、EFFECTS OF TOTAL SAPONINS OF PANAX NOTOGINSENG AND LIGUSTRAZINE ON THE PROLIFERATION OF CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS OF RATS（论文参考文献）
- [1]降香及替代药材对HMWD导致的微循环障碍的影响和其主治相关疾病作用机制的网络药理学探讨[D]. 谢欣序. 江西中医药大学, 2021
- [2]血塞通对MCAO大鼠和OGD/R损伤SH-SY5Y细胞LINGO-1，EGFR，PI3K/AKT通路以及PTEN和GSK-3β的研究[D]. 周东蕊. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元保护作用的研究[D]. 欧阳波. 湖南中医药大学, 2021(02)
- [4]三七皂苷R1对缺血性脑卒中的神经修复作用及分子机制研究[D]. 朱婷. 北京协和医学院, 2021(02)
- [5]芎归方协同BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中血管新生的实验研究[D]. 刘婉莹. 天津中医药大学, 2020
- [6]益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究[D]. 胡艳红. 中国中医科学院, 2020(01)
- [7]参麻益智方调控星形胶质细胞改善VaD大鼠认知功能研究[D]. 李泽惠. 中国中医科学院, 2020(01)
- [8]通络清脑方对缺血性卒中急性脑水肿的影响及星形胶质HMGB1/TLR4机制研究[D]. 田方泽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [9]复方当归注射液对脑缺血损伤大鼠MMP-2/9以及拟缺血损伤神经元的影响[D]. 李韵歆. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]中风醒脑液防治急性脑缺血-再灌注损伤作用及其机制的研究[D]. 姚德祎. 成都中医药大学, 2020(02)