一、HuGM-CSF的生物学功能及临床应用（论文文献综述）
张婧[1]（2019）在《巨噬细胞在皮肤伤口愈合过程中的调控作用及其机制研究》文中提出研究背景及意义:皮肤是机体最大的外部器官,极易遭受各类创伤。因此,皮肤的损伤修复一直是医学领域研究的热点与难点问题。皮肤创面的愈合是一个复杂的过程,包括了止血期、炎症期、增殖期和重塑期在内有序发生并且相继重叠的四个阶段。除了传统的皮片/皮瓣移植外,组织工程皮肤、生长因子、光治疗等新型手段也被应用于皮肤创伤的修复治疗。但由于治疗费用昂贵,材料储存条件苛刻,治疗效果因人而异,涉及医学伦理问题,存在潜在致癌风险等一系列缺陷以及患者与日俱增的需求,研究并开发新的皮肤缺损治疗方法具有重要的意义。巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分,不仅能够快速应答、抵御外界物质对机体的入侵,同时在多种组织器官的损伤后修复和再生过程中发挥关键的调控作用。巨噬细胞除了能够在外周神经、脑、肾脏、肌肉及骨骼损伤过程中分泌生长因子,激活信号通路并促进其修复过程,还通过发挥其吞噬作用,清除受损的坏死组织,防止损伤进一步扩大。缺乏巨噬细胞会直接干扰有尾两栖类脊椎动物附肢再生过程中芽基组织的生成,进而影响整个修复过程,使受损部位不能够再生出正常附肢。但在皮肤组织损伤修复过程中,巨噬细胞发挥的作用尚不明确。基于这些背景,本研究首先对小鼠背部全层皮肤缺损修复过程中巨噬细胞的分布情况进行了观察,随后利用剔除巨噬细胞小鼠模型,在组织水平、基因水平和蛋白水平探讨巨噬细胞数目降低对修复过程的影响。其次,使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulatin Factor,GM-CSF）对小鼠进行皮下注射,系统性提高其体内单核-巨噬细胞系的增殖和分化水平,观察经该方法处理后小鼠皮肤缺损愈合的情况并检测与修复相关的生长因子表达水平的变化,进一步分析巨噬细胞数量增多对皮肤缺损修复的影响。最后,利用液相质谱-色谱串联技术（Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS）鉴定修复早期具有显着表达差异的蛋白分子,分析这些蛋白参与的生物学过程,评价注射GM-CSF后对小鼠皮肤损伤修复过程造成的影响,为阐明巨噬细胞在皮肤创伤愈合过程中的作用和进一步探索开发新的治疗手段提供有力的理论基础。实验方法:本研究共分为四部分:1.制备小鼠背部全层皮肤缺损,在不同时间点对其伤口进行大体拍照和组织学切片染色,观察其缺损修复情况及再上皮化水平,同时分析皮肤组织内的巨噬细胞分布及数量变化情况;2.使用Liposome Clodronate（L-clod）处理小鼠,建立剔除巨噬细胞小鼠模型,通过基于组织学、基因和蛋白水平的多种实验技术方法,以Liposome PBS（L-PBS）处理组为对照,分析缺乏巨噬细胞对皮肤损伤修复造成的影响;3.对小鼠予以皮下注射GM-CSF药品,刺激其体内单核-巨噬细胞系的分化和增殖,利用流式细胞术分析其循环系统中的巨噬细胞数目变化情况,随后评估该方法对皮肤损伤修复过程产生的影响。最后,利用分子生物学手段,检测修复过程中与再生相关的生长因子在基因水平的表达趋势;4.对GM-CSF注射组及其对照组小鼠在0 dpi（days post injury,损伤后天数）、3 dpi、6 dpi时间点的皮肤组织进行总蛋白提取,使用LC-MS/MS技术,对样品蛋白进行鉴定,测定其丰度并进一步分析相关蛋白分子所参与的具体生物学过程。实验结果:1.小鼠背部皮肤受到损伤后,于5 dpi生成大量肉芽组织,10 dpi时再生出直径10 mm大小的圆形缺损上皮,15 dpi时肉芽组织基本消失,修复过程完成。在此期间,巨噬细胞始终可见于受损皮肤组织内并均匀分布在其中。2.使用L-clod处理小鼠后,小鼠皮肤组织内的巨噬细胞数目减少。与其相应的对照组相比,小鼠的伤口愈合速度变慢,修复过程中再上皮化水平明显降低。虽然对比新生皮肤组织的胶原含量发现,两组小鼠的胶原容积率没有区别,但剔除巨噬细胞的小鼠的胶原沉积速率较慢,且胶原纤维束的重排及组织内重塑过程相对滞后。对相关生长因子进行基因和蛋白水平的检测发现,在注射L-clod后,修复过程中实验组小鼠皮肤组织内大部分炎症因子和生长因子的表达下调。3.向小鼠皮下注射GM-CSF后,其外周血内单核-巨噬细胞数目显着升高。与此同时,观察其皮肤损伤修复过程发现,实验组小鼠的伤口较对照组小鼠愈合速度更快,再上皮化水平也明显高于对照组小鼠。除此之外,在修复完成时,GM-CSF注射组小鼠皮肤组织内的胶原含量较低,意味着其疤痕组织相对更小。分析相关生长因子在基因水平的表达趋势发现,实验组小鼠与血管再生、上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition,EMT）及细胞外基质（Extra Cellular Matrix,ECM）降解相关的基因表达水平都不同程度地上调。4.GM-CSF注射组及其对照组小鼠在0、3、6 dpi时间点的皮肤组织蛋白LC-MS/MS分析结果显示,实验组小鼠体内多种蛋白分子表达水平上调,当中的一大部分参与了包括细胞粘附与趋化迁移、抗原处理与呈递、溶酶体、凝血反应以及多种修复相关细胞因子信号通路激活的相关活动。这些蛋白分子之间也存在非常紧密的相互作用。结论:以上实验结果表明,巨噬细胞参与并调控了皮肤损伤修复过程中的多种生物学过程,对皮肤创伤后愈合具有非常重要的作用。使用GM-CSF注射液刺激小鼠外周血循环系统单核-巨噬细胞系的分化和增殖,能够在一定程度上提高与修复相关的多种蛋白分子的表达水平,进而调控并激活与炎症、迁移、增殖等相关的一系列信号通路。这些生物学过程有益于促进小鼠的全层皮肤损伤修复速度,加快其再上皮化过程并减少疤痕组织的生成。本实验结果初步验证了注射GM-CSF系统性提升巨噬细胞数目后,促进皮肤损伤修复的可能性,为开发该方法作为一种新的伤口愈合治疗手段提供了一定理论基础。
王晓玥[2]（2019）在《当归、肉苁蓉“分子身份证”建立及太白贝母异甾体类生物碱合成相关基因挖掘》文中提出随着人民生活水平的提高,同时具有治疗与预防作用的“药食两用”药材受到人们广泛关注。中药材的真伪与药用成分含量是保证药材品质与疗效的基础。一方面,近年来中药产品中原料药材掺假造假问题频发,严重阻碍了中医药产业的发展,进一步影响了中药在全球的声誉。DNA条形码已广泛应用于药用植物、中药材及饮片的鉴定,然而其不适合经过各种深加工,导致DNA严重降解的中药产品的鉴定。为解决DNA降解的材料的鉴定,本文提出了“分子身份证”的概念,即利用一段长为20-50bp特异性短片段,对混合物中某特定物种进行鉴定;本研究基于大样本量ITS2序列分析,开发了正品当归及肉苁蓉药材混淆品（锁阳、沙苁蓉、列当及草苁蓉）的分子身份证,并为当归、肉苁蓉产品的快速准确鉴定提供了依据。（1）当归是常见妇科用药,本文收集了 265份当归及其近缘种、混淆品样品。对ITS2序列进行分析,找到了当归特有的SNP位点,开发了一段长为37-bp的“分子身份证”片段（5’-AATCCGCGTCATCTTAGTGA GCTCAAGGAC CCTTAGG-3’）,应用网上当归属72个物种的573条序列,对此“分子身份证”进行验证,证实为当归特有序列,未知物种与当归分子身份证序列100%一致,则判断为当归,若存在一个碱基以上的变异,则判断不是当归,并设计引物扩增获取此分子身份证区域。对当归粉、提取物和中成药的鉴定结果表明:网上购买的14份当归粉中,有7份被独活替代。对28批含当归中成药中,仅19个批次可判断含有当归,其他批次中还检出了独活、羌活等非标签成分。（2）肉苁蓉是常见滋补佳品,来源于肉苁蓉及管花肉苁蓉两种基原植物。本文对251份肉苁蓉和混淆品样品进行了 DNA提取,同NCBI中325条相关ITS2序列共同分析。以四种常见混淆品（锁阳、沙苁蓉、列当及草苁蓉）的SNP位点为基础,分别开发了 4个长度范围在30～37bp的肉苁蓉混淆品的“分子身份证”,并设计了 6对物种特异性引物扩增获取分子身份证区域,对66种肉苁蓉提取物和中成药的鉴定结果表明:“分子身份证”可成功鉴定混合物中的目标物种,约36.4%的产品中检测到非标签成分,其中肉苁蓉中掺杂锁阳是市场最常见现象。除此之外,如何提高药材品质与疗效也是当前研究的热点,提高药用成分即药材中次生代谢产物的含量成为其中的研究方向之一。“药食两用”药材川贝母资源匮乏,被列入国家三级保护植物名单。近年雾霾天气频发,更加剧了对其资源的需求。其活性成分贝母辛、贝母甲素等属于异甾体类生物碱,目前关于其生物合成途径尚不明确。太白贝母（Fritillaria taipaiensis）是适合低海拔栽种的川贝母基原物种,且甾体生物碱种类含量与川贝母一致。长期以来,一直缺乏对太白贝母基因组、转录组及其相关基因的研究。（1）本研究对太白贝母进行了首次转录组测序。利用2×125 Pair End Illumina测序获得的94,396,694（～11.4 Gb）高质量reads,共组装成190,350个转录本。利用多个数据库进行功能注释,识别出一系列与甾体类生物碱生物合成相关的基因,以及其他次生代谢产物途径,包括甾醇和萜类生物合成途径,以及重要的下游氧化还原酶（如CYP450s）。（2）使用qRT-PCR对甾体类生物碱合成相关酶基因进行了验证,结果表明这些候选基因参与了组织特异性表达。通过对表达结果的分析,相对于叶片而言,鳞茎更有可能是甾体类生物碱上游生物合成途径的主要部位,同时推测包括CYP450s等催化氧化还原反应在内的下游反应可能也发生在鳞茎中。（3）本文成功构建了甾体生物碱合成途径上的5个关键酶——HMGS,HMGR,DXS,ispH,CAS以及待选的氧化还原酶包括CYP450超家族酶（CYP90B1、CYP90D2）,DWF5,DWF1,FK的基因及酿酒酵母或大肠杆菌的表达载体,并诱导了表达载体的蛋白表达,同时探讨了不同诱导条件对蛋白表达的影响。综上,本研究从两个角度对“药食两用”药材进行了研究,一方面开发了当归正品及肉苁蓉四种混淆品分子身份证,并建立了分子身份证鉴定中成药的方法,进一步拓宽了 DNA条形码的研究范畴;另一方面建立的完整的转录组数据将作为一个资源,用于识别潜在的候选基因操作靶向生物活性代谢物,也有助于开发功能相关的分子标记,加快对太白贝母的分子育种和保护工作。本文已构建成功了多个关键酶基因的表达载体,后续将对其催化活性进行分析并确定其功能,为进一步研究甾体生物碱的生物合成奠定基础。
李宁[3]（2011）在《人促甲状腺激素受体抗体定量荧光酶免法的建立及临床应用》文中进行了进一步梳理自身免疫性甲状腺病（autoimmune thyroid disease, AITD）是一类多发病,包括Graves病（Graves’disease, GD）、桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis, HT）等。GD是甲状腺毒症最常见类型,促甲状腺激素受体（TSH receptor, TSHR）是GD的主要抗原,在病理条件下可刺激机体产生TSHR抗体（thyrotropin receptor antibody, TRAb）, TRAb包括甲状腺刺激性抗体（thyroid stimulating antibody, TSAb）、甲状腺刺激阻断性抗体（thyroid stimulating blocking antibody, TSBAb）和中性抗体等自身抗体。其中TSAb可刺激甲状腺激素分泌增多致甲亢。TSAb是GD的主要病因,对GD的发生发展起重要作用。TSHR分膜外区（TSHR-ecd）.跨膜区和膜内区,TRAb结合位点主要分布在TSHR-ecd,研究表明TSAb的抗原表位主要分布于TSHR-ecd的氨基端（TSHRn）。本室在研究TSHR抗原决定簇分布的基础上,将TSHR-ecd分段表达,进行了抗原决定簇分布的筛选,在TSHR-ecd氨基端筛选出主要与TSAb结合的抗原决定簇相对集中的基因片段（TSHRn462bp）,并进行原核表达,获得了能与TSAb结合的该基因片段编码的融合蛋白,即硫氧还蛋白-人促甲状腺激素受体膜外区氨基端片段蛋白（TrxFus-hTSHRn）,为建立TRAb（以TSAb为主）检测技术奠定了基础。荧光酶免疫分析技术（fluorescent-enzyme immunoassay, FEIA）是在酶联免疫分析技术（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）基础上,通过测定酶催化荧光底物发出的荧光强度而建立的一种定量检测超微量物质的荧光酶免疫分析技术,其比ELISA更灵敏、测量范围更宽。本研究以重组TrxFus-hTSHRn为抗原,建立定量检测人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA,并应用于临床,为AITD的诊疗提供依据。目的：应用基因工程技术原核表达hTSHR膜外区氨基端片段基因,获取TrxFus-hTSHRn融合蛋白,以此为抗原建立定量人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA,并应用于临床,探讨其对AITD特别是GD的诊断、鉴别诊断、疗效监测和预后的临床价值。方法：1.人TSHR膜外区氨基端融合蛋白（TrxFus-hTSHRn）原核表达、纯化及鉴定将本室构建的hTSHRn-ecd重组表达质粒pET 102/D-hTSHRn462bp转入表达工程菌E.Coli BL21StarTM（DE3）,诱导表达目的蛋白,经变性Ni2+-NTA（镍一氮川乙酸）亲和层析纯化,梯度透析复性、浓缩,获得重组TrxFus-hTSHRn,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定其分子量,蛋白免疫印迹（Western blotting）鉴定免疫活性。2.以TrxFus-hTSHRn为抗原建立定量人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA及方法学鉴定将重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn包被聚苯乙烯96孔板,以待测样品血清中TRAb为第一抗体,以本室制备的TRAb校准品（WHO推荐的TRAb参考制剂（WHO NIBSC 90/672）的“二次校准物”）建立标准曲线,碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG为第二抗体,4-甲基磷酸伞形酮（4-MUP）为荧光底物建立定量人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA。最佳实验条件的探索：（1）抗原包被量（2）待测样品血清稀释度（3）荧光底物稀释度（4）荧光底物反应时间（5）反应终止液作用时间等因素组合后做交叉试验,确定最佳实验条件。鉴定该法灵敏度、特异性、精密度、准确度、健全性、相关性等指标。检测167例正常人血清样品（均为男性,年龄19-28岁（22.6±2.7））,确立阳性切点值（cut-off point value）。3.定量人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA的临床应用检测6种甲状腺疾病患者559例,分为8组①Graves’病（GD）甲亢初发组：183例（男81例,女102例,年龄18-70岁（40.6±11.2））；②GD治疗3-9个月组：56例（男20例,女36例,年龄28-68岁（39.6±11.0））；③GD治疗1年组：64例（男33例,女31例,年龄32-65岁（42.1±13.9））,④桥本甲状腺炎（HT）初发伴甲减组：112例（男39例,女73例,年龄24-79岁（44.5±13.1））；⑤单纯性甲状腺肿大组：22例（男8例,女14例,年龄19-67岁（42.0±13.1））；⑥结节性甲状腺肿组：49例（男28例,女21例,年龄22-60岁（31.0±12.5））；⑦临床诊断甲状腺腺瘤组：21例（男10例,女11例,年龄17-68岁（38.7±12.4））；⑧亚急性甲状腺炎组：52例（男24例,女28例,年龄21-66岁（45.0±9.0））。4.统计方法人血清TRAb（以TSAb为主）测定浓度（mlU/L）以“均数±标准差”（x±s）表示。组间比较采用方差分析（ANOVA）,各组阳性率比较采用卡方检验（χ2检验）。变量间相关分析采用直线相关分析和一致性检验（kappa分析）。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.人TSHR膜外区氨基端融合蛋白（TrxFus-hTSHRn）原核表达、纯化及鉴定含重组表达质粒pETl 02/D-hTSHRn462bp的表达工程菌E.Coli BL21 StarTM （DE3）在2×YT培养基中37℃过夜摇菌（200rpm）培养,以异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thoiglactoside, IPTG）为诱导剂,终浓度1mM,37℃诱导4小时,产物在变性条件下Ni2+-NTA亲和层析纯化,梯度透析复性、浓缩,获得重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn,经SDS-PAGE测定TrxFus-hTSHRn分子量约为37.5KD,纯度约91.2%,考马斯亮蓝（CBG）法定量,不同批次生产的融合蛋白产率约为21.5-28.4mg/L培养基,Western Blotting鉴定TrxFus-hTSHRn免疫活性良好。2.以TrxFus-hTSHRn为抗原建立定量人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA及方法学鉴定2.1最佳实验条件TrxFus-hTSHRn抗原包被量100ng/孔,4℃过夜；待测样品血清稀释度1：100,37℃温育60分钟；碱性磷酸酶标记羊抗人IgG二抗稀释度1：20000,37℃温育60分钟；荧光底物4-MUP稀释度1：10,37℃避光温育60分钟；加反应终止液50mM乙二胺四乙酸（EDTA）,37℃避光温育5分钟后在荧光仪上测定相对荧光单位（RFU）计数。2.2标准曲线以WHO推荐的TRAb参考制剂（WHO NIBSC 90/672）的“一次校准物”（Medizym（?） T.R.A.Calibrators）为标准（对照品）,对本室制备的TRAb校准品进行标定,并结合临床建立本法的标准曲线,各点浓度分别为（S1-S5）0.07mIU/L, 0.22mIU/L,0.72mIU/L,4.26mIU/L,9.68 mIU/L。2.3结果计算待测样品血清1：100稀释后测得的RFU值在标准曲线上对应的浓度值×100（样品稀释倍数）即为待测样品血清的TRAb（以TSAb为主）浓度（mIU/L）。2.4方法学鉴定①灵敏度：本法检测灵敏度0.05mIU/L。②特异性：TrxFus-hTSHRn与hTRAb特异性结合,与人甲状腺过氧化物酶抗体（hTPOAb）无交叉结合反应。③精密度：阳性血清、阴性血清批内变异（CV%）（n=6）分别为4.47%和9.25%。批间变异（CV%）（n=8）分别为7.29%和13.57%。④准确度：测定高、中、低浓度样品回收率分别为102.13%、97.50%、98.00%,平均回收率97.46%。⑤健全性：将GD甲亢患者血清进行两次对倍稀释后做平行实验,血清样品稀释曲线（r=0.9983）与标准曲线（r=0.9979）成平行关系,本法健全性良好。⑥相关性：本法与意大利索林（DiaSorin）公司放射受体法（RRA） TRAb检测试剂盒同检51例GD患者（不同疗程）血清样品,两法检测结果显着相关（r=0.767,P<0.05；一致性检验kappa=0.791, P<0.01）.2.5确定阳性切点值检测167例健康男性血清TRAb（以TSAb为主）浓度为（x±s）23.5±9.7mIU/L,以x+2s（单侧95%可信区间）为阳性切点值,即42.9 mIU/L。3.定量人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA的临床应用3.16种甲状腺疾病患者血清TRAb（以TSAb为主）含量（mIU/L）分析①GD初发组（142.5±23.2）显着高于其它各组（P均<0.01）。②GD治疗1年组（75.6±35.0）与GD治疗3-9个月组（93.1±30.3）无显着差别（P>0.05）,这两组均显着低于GD初发组（142.5±23.2）（P均<0.01）,但均仍显着高于正常人（23.5±9.7）（P均<0.05）。③GD治疗3-9个月组（93.1±30.3）、GD治疗1年组（75.6±35.0）、HT初发伴甲减组（71.3±14.7）均显着高于单纯性甲状腺肿组（25.6±12.0）、结节性甲状腺肿组（38.7±13.5）、甲状腺腺瘤组（41.0±8.8）、亚急性甲状腺炎组（40.3±10.6）（P均<0.05）。④单纯性甲状腺肿组、结节性甲状腺肿组、甲状腺腺瘤组、亚急性甲状腺炎组与正常人无显着差别（P均>0.05）。3.26种甲状腺疾病患者血清TRAb（以TSAb为主）阳性率分析①GD初发甲亢组阳性率（88.94%）高于其它各组（p均<0.01）。②GD治疗1年组阳性率（38.62%）低于GD治疗3-9个月组（64.09%）（P<0.05）,这两组阳性率均显着低于GD初发甲亢组（88.94%）（P均<0.05）,但仍均显着高于正常人（4.91%）（P均<0.01）。③GD治疗3-9个月组（64.09%）、GD治疗1年组（38.62%）、HT初发伴甲减组（61.88%）均显着高于单纯性甲状腺肿组（0.85%）、结节性甲状腺肿组（3.71%）、甲状腺腺瘤组（5.01%）、亚急性甲状腺炎组（11.69%）（P均<0.05）④单纯甲肿、甲状腺腺瘤、结甲肿、亚甲炎组与正常人无统计学差异（P均>0.05）结论：1.重组表达质粒pET 102/D-hTSHRn462bp在E.Coli BL21 StarTM（DE3）中高效表达,获得了能与TSAb结合的hTSHRn-ecd重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn,该蛋白纯度约91.2%,产率21.5-28.4mg/L培养基,免疫活性好。2.制备并标定了TRAb校准品,建立了以重组融合蛋白TrxFus-hTSHRn为抗原、以96孔板为固相载体的定量检测人血清TRAb（以TSAb为主）FEIA。本法灵敏、特异、稳定、简便。3.本法用于甲状腺疾病患者临床观察,GD甲亢患者检测阳性率较高,本法对AITD特别是GD甲亢的诊断、鉴别诊断、疗效观察有重要价值,对AITD与非AITD的鉴别诊断也有重要意义。
刘杰,蒋成砚,胡俊杰,全舒舟,雷泉[4]（2011）在《犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测》文中进行了进一步梳理为了研究犬粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的作用,试验根据GenBank上发表的犬（Canis familiaris）GM-CSF cDNA基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬GM-CSF基因。结果表明:扩增片段长为435 bp,编码144个氨基酸;生物软件分析结果表明,该序列与猕猴的亲源性更近,与已知人、马、牛、野猪、豹猫、鸡等序列的同源性较低。
傅军科[5]（2009）在《奶牛GM-CSF的克隆、表达、活性检测与乳房炎治疗试验》文中进行了进一步梳理奶牛乳房炎是奶牛乳腺发生的一种炎症,是一种复杂的、导致奶牛业经济损失最严重的疾病。尽管西方一些国家对此病已进行了100多年研究,但至今未能提出一个彻底解决的办法。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）主要由T细胞和巨噬细胞产生,能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体呈集落性生长（即形成集落）。GM-CSF主要作用是对粒细胞系和单核细胞系的维持存活,促进生长、诱导分化和增强功能等。本研究就是想利用GM-CSF的这一功能,结合抗菌药与中药对奶牛乳房炎治疗的新方法进行初步研究,国内在该领域的研究尚未见报道,为此我们主要进行了以下工作:1.奶牛GM-CSF的克隆、表达根据Genebank（U22385）公布的牛GM-CSF基因序列。设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术,从LPS诱导的奶牛肺泡巨噬细胞中,扩增得到奶牛GM-CSF基因,基因全长cDS为432bp。成功克隆到表达载体质粒pET-32a上,将此重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导进行蛋白表达,分子量大小为35KDa左右。2. rboGM-CSF的纯化在成功构建pET-32a-GM-CSF表达载体的基础上,采用调整IPTG浓度与诱导温度的方法来优化诱导表达条件,SDS-PAGE分析发现重组蛋白大部分以包涵体形式存在。而后分别通过尿素变、复性包涵体的方法和Ni-NTA纯化可溶性奶牛GM-CSF的方法纯化重组蛋白。结果表明,应用尿素溶解包涵体,然后在含有递减浓度尿素的缓冲液中分步透析复性,重组蛋白获得率较高;采用Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度更高。3. rboGM-CSF的生物学活性检测采用了软琼脂集落刺激法和MTT比色分析法,对重组蛋白进行了生物学活性检测。结果表明,经MTT比色分析,复性包涵体和Ni-NTA纯化蛋白均有明显的维持奶牛活化淋巴细胞生长和增殖能力,Ni-NTA纯化蛋白在92μg/ml的浓度下促进淋巴细胞增殖能力最强,还发现并不是rboGM-CSF浓度越高对维持活化淋巴细胞生长和增殖作用越强;rboGM-CSF能够刺激奶牛活化淋巴细胞在软琼脂中形成集落,进一步说明纯化蛋白具有良好的生物学活性。4. rboGM-CSF结合抗生素治疗奶牛隐性乳房炎试验先后选择新西兰奶牛48头,按体细胞数分为两组,验证rboGM-CSF单独使用以及与抗菌药联合使用后,对不同体细胞数的奶牛隐性乳房炎的治疗效果。结果表明,单独使用rboGM-CSF对体细胞数在100万个/ml以下的隐性乳房炎奶牛具有50℅的治愈率,而对100万个/ml以上的却没有明显疗效;单独使用庆大霉素对二者的治愈率分别为33℅和16.6℅;与庆大霉素合用后发现对二者的治愈率分别为83.3℅和50℅,说明rboGM-CSF与庆大霉素具有协同作用;注射rboGM-CSF后除了短暂的体温升高,对奶牛没有任何副作用。5. rboGM-CSF结合中药治疗奶牛亚急性临床型乳房炎选择亚急性临床型奶牛新西兰奶牛16头,乳内灌注rboGM-CSF的同时灌服中药（乳炎宝）。将rboGM-CSF与中药合用,旨在寻求一种新的治疗方法。结果表明,二者联合使用后所有奶牛临床症状消失,治愈率达到了87.5℅,有效率为100℅。
李媛[6]（2009）在《BLyS及受体BAFF-R水平在类风湿关节炎中的意义》文中指出目的:检测类风湿性关节炎（RA）患者外周血B淋巴细胞刺激因子（BLyS）及B淋巴细胞表面表达的B淋巴细胞刺激因子受体（BAFF-R）水平,并探讨两者之间的相关性以及两者与DAN积分、血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（ACCP）、免疫球蛋白（Ig）等炎症指标的相关性。指导治疗效果的评价,为进一步揭示RA发生发展的机制提供线索,探讨它们的临床应用价值。方法:整理30例2008年3月至2008年11月我院住院RA患者及20例健康体检者的临床资料。取RA患者外周抗凝血,经过荧光标记后流式细胞仪检测B淋巴细胞表面BAFF-R的表达率,用酶联免疫吸附（ELISA）方法检测血清BLys,并检测患者治疗后BAFF-R及血清BLyS水平,同时收集患者治疗前DAS积分、ESR、CRP、RF、ACCP、Ig等数据进行相关性分析,结果经SPSS统计软件进行检验。结果:1.RA患者血清BLyS水平较正常对照组比较有统计学差异,P<0.05。2.RA患者B淋巴细胞表面BAFF-R（%）水平较正常对照组比较有统计学差异,P<0.05。3.RA患者血清BLyS水平与B淋巴细胞表面BAFF-R（%）水平呈正相关,P<0.05。4.RA患者血清BLyS水平在治疗前后比较有统计学差异,P<0.05。5.RA患者B淋巴细胞表面BAFF-R（%）水平在治疗前后比较有统计学差异,P<0.05。6.RA患者B淋巴细胞表面BAFF-R（%）水平与DAS积分、血清免疫球蛋白G（IgG）、ESR、CRP、RF、ACCP水平正相关,P<0.05;与病程、晨僵时间、血清免疫球蛋白A（IgA）、血清免疫球蛋白M（IgM）无相关性,P>0.05。结论:1.RA患者血清BlyS及B淋巴细胞表面BAFF-R水平升高,高于健康对照组,并与RA疾病活动情况有关,与RA临床活动性评分所反映的病情一致,可以作为RA诊断的辅助指标之一。2.RA患者治疗前后血清BlyS及B淋巴细胞表面BAFF-R水平差异显着,故二者水平的测定可对RA预后有一定指导作用,指导RA治疗效果的评价。3.RA患者血清BLyS及B淋巴细胞表面BAFF-R水平变化可能参与了RA的病理生理过程,并与RA疾病的活动情况相关,可以判断RA患者的疾病活动性,并对RA的治疗效果有一定评价作用。可以作为治疗靶点之一。
韩国全[7]（2009）在《含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用》文中研究指明为适应以减毒胞内寄生菌为运载体的兽用基因疫苗研究发展趋势,研究构建含有减毒胞内寄生菌自身内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,以增强基因疫苗诱导有效保护性免疫。基于以上考虑,本课题研究旨在研制含猪霍乱沙门菌内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗通用表达载体,既能够在运载体原核细胞中可调控表达携带抗原基因,又能够在真核细胞中启动表达携带抗原基因,以期与S.C500合用开发适于粘膜免疫的猪群重组活菌疫苗。为此,本研究首先扩增出猪霍乱沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,然后分析其启动活性,进一步构建新型双功能表达载体pCB-neo、pCC-neo,系统研究表达载体的启动活性特点,检验S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo基础构建的基因疫苗的可行性。本课题研主要研究内容包括:Ⅰ.猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析为获得沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,利用PCR技术从猪霍乱沙门菌疫苗株S.C500基因组DNA中扩增出启动子PnirB、PpagC基因区域片段,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组质粒pUCX-PnirB、pUCX-PpagC。序列分析结果显示启动子PnirB、PpagC与其它沙门菌相关序列核苷酸同源性较高,分别为96%～100%、93%～99%,其中与霍乱沙门菌SC-B67核苷酸同源性分别高达100%、99%,说明两启动子基因区域高度保守。生物信息学网络软件NNPP分析结果显示,PnirB启动子基因区域序列有3个较强的启动子Promotor序列,PpagC启动子基因序列有12个较强的启动子Promotor序列,说明试验所扩增的两个基因启动子区域片段具有启动基因表达的基本元件。Ⅱ.沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究为考察沙门菌启动子的启动表达能力及特点,运用基因工程技术构建携带有沙门菌内源性启动子PnirB、Ppagc的单一启动子表达载体pPB、pPC,进一步构建其报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP,并转化到S.C500中进行相应的诱导性表达。通过表达菌液荧光观察、菌细胞表达荧光检测、SDS-PAGE检测,确证EGFP的获得成功表达,证实克隆获得的启动子PnirB、PpagC区域基因片段在S.C500中具有启动活性。Ⅲ.新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建及表达活性研究为研制含沙门菌内源启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,利用PCR技术亚克隆启动子必需区域基因片段PnirB（CB）（190bp）、PpagC（CC）（490bp）,并设计添加SD-Kozak杂合序列,替换pCI-neo启动子Pcmv下游的Chimeric intron基因区域,构建双功能疫苗表达载体pCB-neo、pCC-neo。进一步构建报告基因载体pCB-EGFP、pCC-EGFP。实现EGFP在S.C500中表达,证实PnirB（CB）、PpagC（CC）可以在S.C500中驱动外源基因的表达;实现EGFP在Vero细胞中表达,证实原载体中启动子Pcmv可以在Vero中驱动外源基因的表达,说明下游新插入的启动子不影响其启动活性:实现EGFP在小鼠体外培养巨噬细胞中表达,进一步证实S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo为表达载体构建的新型基因疫苗的可行性。Ⅳ.内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究为获得内江猪白细胞介素15基因序列片段,利用RT-PCR技术从经由Con A刺激的内江猪PMBC扩增了pIL-15基因,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组克隆质粒pUCX-njpIL-15。构建原核表达载体pMAL-pmIL-15,实现pIL-15在大肠杆菌中高效表达。MTT法试验显示融合产物MBP-pmIL-15经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖。构建真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD（PRV）联合肌注免疫BALB/c雌性小鼠试验显示,pCI-pIL15能够促进小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞数量增殖,加强基因疫苗pCI-gD（PRV）特异性中和抗体的产生:试验证实内江猪IL-15具有免疫佐剂作用。Ⅴ.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的分子克隆与原核表达研究为获CSFV-E2基因片段,利用RT-PCR技术从PK-15细胞增殖的CSFV四川分离株中成功分子克隆E2基因,含有编码E2蛋白完整基因序列,共1119 bp,编码373 aa。构建原核表达载体pET-mE2（pe）、pET-E2（pe）,转化到宿主菌E.coli Rosetta-gami-TM（DE3）plysS进行表达研究,SDS-PAGE电泳检测及Western blot分析结果显示,试验成功表达的mE2（pe）、E2（pe）均具有一定的生物学免疫反应活性。CSFV-E2主要抗原位点区域（mE2）的成功原核表达,为进一步研究新型猪瘟病毒基因疫苗奠定理论基础。Ⅵ.猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究运用分子生物学实验技术将内江猪IL-15成熟肽基因与CSFV-E2主要抗原位点区域基因有机连接,构建融合双基因的克隆重组质粒pUCX-ME2-IL-15。构建真核表达载体pEGFP-ME2-IL-15,转染到Vero细胞中,荧光检测证实表达出增强型绿色荧光蛋白融合蛋白,证实试验构建的目的融合双基因ME2-IL-15可以在真核Vero细胞中获得表达,为进一步研究融合双基因ME2-IL-15奠定理论基础。构建融合双功能重组表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照真核重组表达载体pCI-ME2-IL-15,分别将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15转化到S.C500,SDS-PAGE电泳及Western-blott检测显示融合双基因ME2-IL-15在S.C500中成功表达,证实PnirB（CB）、PpagC（CC）可以在S.C500中驱动融合双基因ME2-IL-15的表达:将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15转染到哺乳动物Vero细胞中,mRNA转录、间接免疫荧光及夹心ELISA检测结果证实Pcmv可以在Vero中驱动外源基因ME2-IL-15的表达。为进一步研究S.C500运载双基因融合表达基因疫苗奠定试验基础。Ⅶ.融合双基因疫苗在S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力影响的研究为了考察融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力的影响,试验对构建的重组工程活菌苗进行系统研究。结果显示,双功能表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照pCI-ME2-IL-15存在与否不影响运载菌S.C500的生物学特性,对其生化鉴定特性亦不影响,除Amp抗性外,重组菌与运载菌的药敏性一致;基因疫苗表达载体所插入的融合双基因ME2-IL-15增加其在运载菌S.C500体内的稳定性;基因疫苗的存在使运载菌S.C500对ST细胞的粘附能力、侵袭能力及其在ST细胞体内的增殖能力均有一定程度的下降,对运载菌本身的免疫效应有一定影响;口服免疫28日龄BALB/c雌性小鼠具有一定的稳定性和免疫安全性,可以有效的将基因疫苗运载至免疫小鼠机体细胞;为研究S.C500运载基因疫苗的免疫应答奠定前提。Ⅷ.融合双基因疫苗重组S.C500活菌苗口服接种家兔的免疫应答初步研究为检测家兔血清中S.C500抗体水平,建立猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法,确立抗原最佳包被浓度为0.305μg/mL,血清最适稀释度为1:40,试验测定血清样品的D492 nm值,判定标准通过标准阴性血清按照P/N比值公式进行判断,P/N≥2.1为阳性,1.5＜P/N≤2.1为可疑,1.5＜P/N为阴性;可以间接反应抗体水平的高低。家兔血清CSFV抗体检测结果显示对照A组（口服PBS缓冲液对照）无CSFV抗体,B组（口服S.C500/pCB-ME2-IL-15）、C组（口服S.C500/pCC-ME2-IL-15）、D组（口服S.C500/pCI-ME2-IL-15）、E组（口服S.C500/pCI-ME2）首免后14天即已产生CSFV抗体,第二、三次均呈上升趋势,B、C组免疫效果优于D、E组,B、C组之间相比C组免疫效果稍好,D、E组之间相比D组免疫效果稍好,试验研制的双功能疫苗通用表达载体pCB-neo、pCC-neo具有一定优势;S.C500抗体检测结果显示,试验构建的四个重组工程菌组经灌服均产生了较高的抗体水平,对照灌服PBS缓冲液组未能检测到抗S.C500特异性抗体的存在。免疫家兔T淋巴细胞增殖检测分析显示,对照A组家兔三次T淋巴细胞增殖率均低于15%,之间差异亦不大;B、C、D、E四个口服免疫组T淋巴细胞增殖率均高于18%以上,末次免疫后14d,B组增殖率有小幅度下降,C、D、E三组增殖率均有不同程度的增强提高。于末次免疫后14d,用4头份猪瘟兔化弱毒脾淋苗肌肉注射进行攻毒,以热反应为判定标准,保护率依次为0%、40%、60%、40%、25%,说明S.C500为运载体的猪瘟基因疫苗能够诱导家兔产生一定抗CSFV的保护性特异抗体,其中试验研制的基因疫苗通用表达pCC-neo携带的抗原基因保护率较高,具有一定优势。采用4×1010 CFU/只剂量的猪伤寒沙门菌野毒株口服接种攻毒试验,结果表明试验所构建的四个重组工程菌均能够诱导家兔产生一定水平的抗猪伤寒沙门菌野毒株的保护性特异抗体。
朱书峰[8]（2008）在《计算机辅助HSA-hGCSF融合蛋白的分子改造》文中认为粒细胞集落刺激因子（G-CSF）主要来源于巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞,具有高度特异性的刺激中性白细胞系的功能。G-CSF作为药物分子已广泛应用于临床,其主要的不足有生物活性低、体内稳定性差和体内半衰期短等。本文设计G-CSF突变体期望提高G-CSF的生物活性,采用白蛋白融合表达技术提高G-CSF的体内稳定性,为长效G-CSF的研究创造条件。依据G-CSF的结晶结构信息,我们利用Swiss-pdb Viewer 3.7软件的同源建模功能构建出融合蛋白突变体的三维结构。在Hyper Chem软件中计算各融合蛋白突变体的单点能,并与突变前作比较。单点能计算显示,对远离活性位点的5个氨基酸残基进行的突变得到的结构分子能量最小。分析各突变体的G-CSF骨架结构与野生型G-CSF骨架结构的差异,表明那些能保留活性作用结构的突变体其突变位点均接近N端,与单点能计算结果综合分析,认为M8突变体生物特性与天然构象相似,活性位点的两个重要氢键（19-Glu-O与173-Tyr-O、22-Arg-N与238-His-O）得到保留。选取活性和半衰期有望提高的突变方案M8,将其在毕赤酵母系统中进行表达,并对融合蛋白进行了鉴定,验证理论计算的合理性和可行性。全合成人G-CSF基因突变体的序列（hG-CSFm）,插入克隆载体pBlu2KSP-HSA中,构建重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSFm。测序结果显示克隆得到的hG-CSFm基因与突变方案的序列完全一致。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切重组质粒,回收HSA-hGCSFm片段,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k中,构建表达载体pPIC9K- HSA-hGCSFm。经限制性酶切分析证明融合基因已经成功地插入到载体pPIC9k中,测序结果表明HSA-hGCSFm融合基因与预期的一致。表达载体经SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,以MD平板进行初筛,得到的重组子进行诱导表达分析。将表达量较高的重组毕赤酵母进行表达产物鉴定和G-CSF活性分析,优化诱导时间和诱导剂浓度后,对融合蛋白进行初步的分离纯化。诱导表达筛选得到1株表达200 mg/L目标蛋白的重组菌32。Western杂交显示表达产物具有很好的HSA抗原性,分子量约84 kDa;NFS-60细胞/MTT比色法测定表达产物具有G-CSF的生物学活性,野生型融合蛋白的比活性为5×104IU/mg,突变后提高为1.5×106IU/mg,说明重组菌32可成功表达具有G-CSF生物活性的HSA-hGCSFm融合蛋白。
孔纯玉[9]（2008）在《系统性红斑狼疮患者血清BlyS水平的研究》文中研究表明目的:多种细胞因子在SLE的发生发展中起到重要作用。本研究通过对活动期和稳定期、合并狼疮肾炎和不合并狼疮肾炎、治疗前后的SLE患者以及正常对照组血浆BlyS的水平进行检测,分析SLE疾病活动与患者血浆BlyS水平之间的关系,探讨BlyS在SLE发病中尤其发生肾损伤时的可能作用。分析SLE患者血浆BlyS与IgG、IgA、IgM、补体C3、C4、抗ds-DNA抗体、24小时尿蛋白、SLEDAI评分、血沉及C反应蛋白等的关系,试图寻找到相对特异和敏感的生物学标记物辅助临床对SLE的诊断和判断预后,并指导治疗效果的评价。为进一步揭示SLE发生发展的机制提供线索。方法:整理30例2007年3月至2007年10月我院住院SLE患者、20例同期住院非狼疮结缔组织病患者及20例健康体检者的临床资料。用酶联免疫吸附方法（ELISA）测定SLE组、非SLE结缔组织病组及正常对照组血浆BlyS的水平,比较病情活动期和稳定期、合并狼疮肾炎和不合并狼疮肾炎及治疗前后的SLE患者组及正常对照组间BlyS水平的差异。分析血浆BlyS水平与IgG、IgA、IgM、补体C3、补体C4、24h尿蛋白定量、抗ds-DNA抗体、SLEDAI评分、血沉及C反应蛋白的相关性。结果:1.SLE组血清BlyS水平高于非SLE结缔组织病组及正常对照组,P＜0.05;非SLE结缔组织病组血清BlyS水平也高于正常对照组,P＜0.05;2.SLE病情活动组血清BlyS水平高于SLE病情稳定组和正常对照组,P＜0.05;SLE病情稳定组血清BlyS水平也高于正常对照组,P＜0.05;3.狼疮性肾炎（lupus nephritis,LN）组血清BlyS水平高于无肾损害SLE组及正常对照组,P＜0.05;无肾损害SLE组血清BlyS水平高于正常对照组,P＜0.05;4.SLE患者治疗前血清BlyS水平高于治疗后,差别有显着性,P＜0.05;5.血清BlyS水平与SLEDAI评分、24h尿蛋白、抗ds-DNA抗体、IgG、IgA、IgM、及C反应蛋白水平呈正相关,P＜0.05;与补体C3水平呈负相关,P＜0.05;与抗核抗体滴度、血沉、补体C4及病程水平无相关性,P＞0.05。结论:1.SLE患者血清BlyS水平升高,高于非SLE结缔组织病患者及正常对照,并与SLE疾病活动情况有关,与SLE临床活动性评分所反映的病情一致,可以作为SLE诊断的辅助指标之一。2.SLE患者血清BlyS水平升高与肾脏损害有关,能预测SLE发生肾脏损害。检测血清BlyS水平可以作为SLE累及肾脏的一个指标。BlyS水平升高,结合SLE患者的临床症状及血尿、蛋白尿等指标可以作为监测狼疮肾炎活动的无创的重要指标。3.SLE患者治疗前后血清BlyS水平差异显着,故血清BlyS水平的测定可对SLE预后有一定指导作用,指导SLE治疗效果的评价。4.SLE患者血清BlyS水平可以作为SLE诊断指标之一并判断SLE疾病活动性,可能作为SLE生物治疗的药物靶点。
王传生,王庆林[10]（2005）在《huGM-CSF研究现状》文中提出
二、HuGM-CSF的生物学功能及临床应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HuGM-CSF的生物学功能及临床应用（论文提纲范文）
（1）巨噬细胞在皮肤伤口愈合过程中的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 皮肤组织的基本结构与损伤修复 |
| 1.1.1 皮肤的生理和解剖学结构 |
| 1.1.2 皮肤损伤修复过程 |
| 1.2 巨噬细胞 |
| 1.2.1 巨噬细胞的发育 |
| 1.2.2 巨噬细胞的分类 |
| 1.2.3 皮肤组织内的巨噬细胞 |
| 1.3 巨噬细胞与组织修复及再生 |
| 1.3.1 巨噬细胞与神经及血管再生 |
| 1.3.2 巨噬细胞与骨损伤愈合 |
| 1.3.3 巨噬细胞与脏器损伤修复 |
| 1.3.4 巨噬细胞与肌肉损伤修复 |
| 1.3.5 巨噬细胞与附肢再生 |
| 1.4 皮肤损伤修复的治疗手段及优缺点 |
| 1.4.1 移植及组织工程皮肤 |
| 1.4.2 生长因子局部给药治疗 |
| 1.4.3 细胞疗法 |
| 1.4.4 其他治疗方式 |
| 1.5 本实验的研究意义与技术路线 |
| 第二章 巨噬细胞在皮肤伤口愈合过程中的分布情况观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验主要仪器 |
| 2.2.2 实验试剂及耗材 |
| 2.2.3 实验主要溶液配制方法 |
| 2.2.4 数据采集及分析软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 皮肤缺损及皮肤组织样品的收集 |
| 2.3.2 皮肤组织样品的石蜡包埋与切片 |
| 2.3.3 免疫组织化学染色 |
| 2.3.4 组织切片的H&E染色 |
| 2.3.5 大体照片的拍摄及修复面积数据统计方式 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 小鼠背部皮肤缺损后的愈合情况观察 |
| 2.4.2 小鼠背部皮肤缺损的再上皮化过程观察 |
| 2.4.3 小鼠皮肤修复过程中的巨噬细胞分布情况 |
| 2.5 本章小结与讨论 |
| 第三章 巨噬细胞在皮肤伤口愈合过程中的作用及其机理 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验主要仪器 |
| 3.2.2 实验试剂及耗材 |
| 3.2.3 实验主要溶液配制方法 |
| 3.2.4 数据采集及分析软件 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 巨噬细胞剔除小鼠皮肤缺损模型的建立 |
| 3.3.2 皮肤组织样品的收集 |
| 3.3.3 皮肤组织样品的石蜡包埋与切片 |
| 3.3.4 免疫组织化学染色(HRP显色) |
| 3.3.5 组织切片的H&E染色 |
| 3.3.6 组织切片的Masson三色染色 |
| 3.3.7 组织切片的天狼星红染色 |
| 3.3.8 组织总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 3.3.9 引物设计及相关基因表达水平的RT-qPCR检测 |
| 3.3.10 组织总蛋白的提取及处理 |
| 3.3.11 ELISA法检测相关蛋白水平表达量 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 剔除巨噬细胞组小鼠的皮肤缺损修复率统计结果 |
| 3.4.2 剔除巨噬细胞组小鼠的再上皮化情况 |
| 3.4.3 剔除巨噬细胞组小鼠的胶原沉积分析 |
| 3.4.4 剔除巨噬细胞组小鼠的白细胞分布情况 |
| 3.4.5 剔除巨噬细胞组小鼠修复过程中相关基因的表达分析 |
| 3.4.6 剔除巨噬细胞组小鼠修复相关因子蛋白水平表达分析 |
| 3.5 本章小结与讨论 |
| 第四章 注射 GM-CSF 对小鼠皮肤缺损修复的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验主要仪器 |
| 4.2.2 实验试剂及耗材 |
| 4.2.3 实验溶液配制方法 |
| 4.2.4 数据采集及分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 巨噬细胞升高小鼠皮肤缺损模型的建立 |
| 4.3.2 皮肤组织样品的收集 |
| 4.3.3 皮肤组织样品的石蜡包埋与切片 |
| 4.3.4 免疫组织化学染色 |
| 4.3.5 组织切片的H&E染色 |
| 4.3.6 组织切片的Masson染色 |
| 4.3.7 组织总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 4.3.8 引物设计及相关基因表达水平的RT-qPCR检测 |
| 4.3.9 外周血流式细胞样品的处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 注射GM-CSF后小鼠外周血单核-巨噬细胞数目变化情况 |
| 4.4.2 GM-CSF注射组小鼠皮肤缺损修复率统计 |
| 4.4.3 GM-CSF注射组小鼠再上皮化情况 |
| 4.4.4 GM-CSF注射组小鼠胶原沉积情况 |
| 4.4.5 GM-CSF注射组小鼠白细胞分布情况 |
| 4.4.6 GM-CSF注射组小鼠修复相关因子的基因水平表达分析 |
| 4.5 本章小结与讨论 |
| 第五章 GM-CSF作用下小鼠修复过程中的蛋白组学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验主要仪器 |
| 5.2.2 实验试剂及耗材 |
| 5.2.3 实验溶液配制方法 |
| 5.2.4 数据采集及分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 组织样品的收集 |
| 5.3.2 组织总蛋白的提取 |
| 5.3.3 蛋白BCA定量 |
| 5.3.4 多肽段样品的准备 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 GO注释及基因功能富集分析 |
| 5.4.2 KEGG通路分析 |
| 5.4.3 蛋白-蛋白互作分析 |
| 5.5 本章小结与讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）当归、肉苁蓉“分子身份证”建立及太白贝母异甾体类生物碱合成相关基因挖掘（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. “药食两用”药材应用现状 |
| 2. 中药材及其产品真伪研究现状 |
| 2.1 中药材及其产品混伪掺伪现状 |
| 2.2 造成中药材真伪掺杂的原因 |
| 2.3 DNA条形码优缺点及“分子身份证”方法开发 |
| 3. 中药材质量影响因素 |
| 4. 转录组学及RNA-Seq技术概述及其应用 |
| 4.1 转录组学概述 |
| 4.2 RNA-Seq技术及其在生物领域中的应用 |
| 4.3 RNA-Seq在药材次生代谢产物生物合成和代谢途径中的应用 |
| 5. 展望 |
| 6. 本研究目的与创新性 |
| 参考文献 |
| 第二章 当归“分子身份证”的开发及其在中成药鉴定中的应用 |
| 1. 实验材料及试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验所用试剂及其配制方法 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 当归“分子身份证”标准数据库构建 |
| 2.2 当归“分子身份证”验证及市售药材鉴定 |
| 2.3 目的片段克隆鉴定 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 当归“分子身份证”的开发及特异性验证 |
| 3.2 当归“分子身份证”扩增效率验证及其在市售当归中成药中的鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 肉苁蓉混淆品“分子身份证”的开发及其在中成药鉴定中的应用 |
| 1. 实验材料及试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验所用试剂及其配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 四种肉苁蓉混淆品“分子身份证”标准数据库构建 |
| 2.2 物种特异性引物设计及DNA降解产品鉴定 |
| 2.3 实时荧光定量PCR验证引物灵敏度 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 肉苁蓉“分子身份证”及特异性引物的开发 |
| 3.2 “分子身份证”序列及引物特异性验证 |
| 3.3 通过“分子身份证”与物种特异性引物检测中成药掺伪情况 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 含有肉苁蓉市售药品监管新方法的开发 |
| 4.2 “分子身份证”法可高效鉴定肉苁蓉产品 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于RNA-Seq转录组数据解析太白贝母生物碱合成途径相关基因 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 样品RNA提取及Illumina Hiseq 2500测序 |
| 2.2 实时荧光定量PCR基因表达模式分析 |
| 2.3 HPLC-ELSD方法检测太白贝母样品生物碱含量 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 RNA样品提取及测序文库构建 |
| 3.2 RNA测序及de novo组装 |
| 3.3 转录组数据功能注释与分类 |
| 3.4 不同年份太白贝母鳞茎间的差异表达基因及次生代谢途径基因分析 |
| 3.5 甾体生物碱合成途径基因表达模式及荧光定量PCR分析 |
| 3.6 太白贝母甾体生物碱合成途径可能涉及的氧化还原酶分析 |
| 3.7 甾体类生物碱含量与代谢途径相关基因表达量相关性分析 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 甾体生物碱合成相关酶基因克隆与表达 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 候选基因克隆 |
| 2.2 候选基因蛋白结构预测 |
| 2.3 重组质粒构建 |
| 2.4 重组质粒表达及检测 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 候选基因克隆及结构分析 |
| 3.2 甾体生物碱合成途径相关酶基因同源性分析 |
| 3.3 克隆序列构建表达载体及表达结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）人促甲状腺激素受体抗体定量荧光酶免法的建立及临床应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、人TSHR膜外区氨基端融合蛋白(TrxFus-hTSHRn)原核表达、纯化及鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、以TrxFus-hTSHRn为抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA及方法学鉴定 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、定量人血清TRAb(以TSAb为主)FEIA临床应用 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 重组人TSHR和人血清TRAb检测技术的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（5）奶牛GM-CSF的克隆、表达、活性检测与乳房炎治疗试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 绪论 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一 GM-CSF 研究动态 |
| 1. GM-CSF 的概念和分类 |
| 2. GM-CSF 的产生和调节 |
| 3. GM-CSF 的生物学功能 |
| 4. GM-CSF 的应用 |
| 二 奶牛乳房炎概况 |
| 1 奶牛乳房炎的发病类型与症状 |
| 2 乳房炎的诊断方法 |
| 3 奶牛乳房炎发病主要原因 |
| 4 奶牛乳房炎的防治研究现状 |
| 三 细胞因子方法治疗乳房炎的研究动态 |
| 1 细胞因子在兽医临床上的研究与应用 |
| 2 细胞因子在治疗奶牛乳房炎中的研究与应用 |
| 四 存在的问题 |
| 五 本试验研究意义 |
| 第二部分 试验部分 |
| 试验一 奶牛GM-CSF 的克隆、表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞及载体 |
| 1.2 菌株及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 脂多糖诱导绵羊肺泡巨噬细胞试验 |
| 1.6 RNA 的提取与反转录PCR |
| 1.7 基因克隆与鉴定 |
| 1.8 奶牛GM-CSF 表达载体的构建 |
| 2. 结果及分析 |
| 2.1 提取总RNA 进行RT-PCR |
| 2.2 含pGEM–T-GM-CSF 载体质粒的克隆菌PCR 鉴定 |
| 2.3 pGEM–T-GM-CSF 载体质粒双酶切鉴定 |
| 2.4 基因序列测定 |
| 2.5 基因序列及氨基酸序列的比较并绘制进化树 |
| 2.6 含pET32a-GM-CSF 表达载体质粒的克隆菌PCR 鉴定 |
| 2.7 pET32a-GM-CSF 表达载体质粒的双酶切鉴定 |
| 2.8 奶牛GM-CSF 基因表达结果 |
| 2.9 奶牛GM-CSF 蛋白二级结构与3D 模型构建 |
| 3. 讨论 |
| 试验二 rboGM-CSF 的变、复性研究与纯化 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 菌体的诱导与收集 |
| 1.5 菌体的裂解及利用Ni-NTA 蛋白纯化柱纯化蛋白 |
| 1.6 利用包涵体的变性与复性纯化蛋白 |
| 1.7 SDS-PAGE |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 试验三 rboGM-CSF 的生物学活性检测 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 MTT 法检测rboGM-CSF 活性 |
| 1.5 集落形成试验检测rboGM-CSF 活性 |
| 2. 结果 |
| 2.1 淋巴细胞分离结果 |
| 2.2 MTT 法检测重组蛋白对淋巴细胞增殖效果 |
| 2.3 集落形成试验检测重组生物学蛋白活性 |
| 3. 讨论 |
| 试验四 rboGM-CSF 结合抗生素治疗奶牛隐性乳房炎试验 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料与主要仪器 |
| 1.2 环境条件 |
| 1.3 试验牛的管理与选择 |
| 1.4 试验方案 |
| 1.5 牛奶SCC 计数 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 体温与日产奶量 |
| 2.2 SCC 计数 |
| 3. 讨论 |
| 试验五 rboGM-CSF 结合中药治疗奶牛亚急性临床型乳房炎 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验牛的管理 |
| 1.2 环境条件 |
| 1.3 试验材料与主要仪器 |
| 1.4 试验方案 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 体温变化情况 |
| 2.2 SCC 计数 |
| 3. 讨论 |
| 论文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 相关试剂配制 |
| 致谢 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
| 个人简历及发表论文 |
（6）BLyS及受体BAFF-R水平在类风湿关节炎中的意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1.研究对象和分组 |
| 2.研究方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 |
| 综述正文 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（7）含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 前言 |
| 1 研究背景、基础和目的意义 |
| 2 拟解决的问题 |
| 3 主要研究内容 |
| 4 整体技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗运载体研究进展 |
| 1 沙门菌的特征 |
| 2 沙门菌的侵染机制 |
| 3 沙门菌的减毒 |
| 4 减毒沙门菌的胞内定位及对基因疫苗的运送 |
| 5 运送基因疫苗减毒沙门菌诱发机体免疫应答的机制 |
| 6 减毒猪霍乱沙门菌作为疫苗的应用 |
| 7 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的应用 |
| 8 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的优点及潜在的威胁 |
| 第二章 猪瘟病毒研究进展 |
| 1 猪瘟病毒概述 |
| 2 猪瘟病毒的病原学研究 |
| 3 猪瘟病毒分子生物学研究 |
| 4 猪瘟病毒致细胞病变型的研究 |
| 5 猪瘟病毒疫苗研究 |
| 6 猪瘟病毒与动物性食品安全 |
| 7 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 S.C500细菌活化培养 |
| 1.2.4 S.C500细菌基因DNA的提取制备 |
| 1.2.5 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
| 1.2.6 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域扩增产物的TA克隆 |
| 1.2.7 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR产物的TA克隆质粒初步鉴定 |
| 1.2.8 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域TA克隆质粒测序鉴定 |
| 1.2.9 S.C500 nirB、pagC基因启动子扩增区域的序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
| 2.2 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列TA克隆质粒鉴定 |
| 2.3 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列测定及结果分析 |
| 2.4 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 报告基因EGFP的质粒PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.4 基因片段PnirB、PpagC的质粒PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.5 含启动子PnirB、PpagC表达载体的构建 |
| 1.2.6 含报告基因EGFP重组载体的构建 |
| 1.2.7 报告基因EGFP在S.C500中的表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 报告基因克隆质粒pUCX-EGFP构建 |
| 2.2 目的基因克隆质粒pUCX-PnirB(PB)、pUCX-PpagC(PC)构建 |
| 2.3 表达载体pPB、pPC构建 |
| 2.4 报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP构建 |
| 2.5 重组菌S.C500/pPB-EGFP、S.C500/pPC-EGFP的表达研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 新型双功能通用表达载体的构建及启动活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 启动子基因PnirB(CB)、PpagC(CC)的PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.4 新型基因疫苗表达载体的构建 |
| 1.2.5 新型基因疫苗报告载体的构建 |
| 1.2.6 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
| 1.2.7 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中瞬时表达研究 |
| 1.2.8 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP的稳定性分析 |
| 1.2.9 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP在体外培养小鼠巨噬细胞中表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 克隆质粒pUCX-PnirB(CB)、pUCX-PpagC(CC)的构建 |
| 2.2 新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建 |
| 2.3 新型基因疫苗报告载体的构建 |
| 2.4 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
| 2.5 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中表达研究 |
| 2.6 重组菌体外培养稳定性 |
| 2.7 重组菌感染体外培养小鼠巨噬细胞的荧光观察 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 内江猪IL-15基因的克隆和序列分析 |
| 1.2.4 内江猪IL-15基因的原核表达研究 |
| 1.2.5 原核表达产物的活性检测 |
| 1.2.6 内江猪IL-15基因的免疫佐剂作用研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 内江猪IL-15基因的RT-PCR扩增及TA克隆 |
| 2.2 内江猪IL-15基因序列分析 |
| 2.3 原核表达载体DMAL-pmIL15的构建 |
| 2.4 原核表达条件优化及其产物Western blot分析 |
| 2.5 融合表达产物的生物活性检测 |
| 2.6 pIL-15基因的免疫增强作用 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 猪瘟病毒E2基因的分子克隆与原核表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 CSFV-E2基因的分子克隆与序列分析 |
| 1.2.4 CSFV-E2蛋白主要抗原区编码基因的TA克隆质粒构建 |
| 1.2.5 原核重组表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
| 1.2.6 pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)在大肠杆菌中的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CSFV-E2基因的分子克隆 |
| 2.2 CSFV-E2基因的序列分析 |
| 2.3 克隆质粒pUCX-mE2(pe)、pUCX-E2(pe)的构建 |
| 2.4 原核表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
| 2.5 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.6 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的Western Blot分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
| 1.2.4 融合双基因重组表达载体的构建 |
| 1.2.5 pEGFP-dME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
| 1.2.6 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
| 1.2.7 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细胞中的瞬时表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
| 2.2 融合双基因重组表达载体的构建 |
| 2.3 pEGFP-ME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
| 2.4 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
| 2.5 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细的瞬时表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第七章 融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及免疫安全性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 重组菌生长特性、生化特性、药敏特性及血清学特性鉴定 |
| 1.2.3 重组菌体外增殖中重组质粒的稳定性 |
| 1.2.4 携质粒SC500对ST细胞的粘附、侵袭力和增殖 |
| 1.2.5 携质粒S.C500口服免疫BALB/c小鼠 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组工程菌体外培养特性检测 |
| 2.2 S.C500体外培养中质粒的稳定性 |
| 2.3 携质粒S.C500对ST细胞的粘附、侵袭和增殖能力的影响 |
| 2.4 携质粒S.C500免疫BALB/c小鼠 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第八章 融合双基因表达载体重组S.C500活菌疫苗口服接种家兔的体内免疫应答初步研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
| 1.2.2 双基因融合表达载体重组工程菌的活化培养 |
| 1.2.3 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 1.2.4 口服免疫重组工程菌菌液的制备 |
| 1.2.5 试验家兔的口服免疫接种 |
| 1.2.6 免疫家兔血清抗体水平检测 |
| 1.2.7 免疫家兔T淋巴细胞增殖检测 |
| 1.2.8 免疫后家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒试验 |
| 1.2.9 免疫后家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
| 2.2 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3 免疫家兔抗CSFV特异性抗体的检测 |
| 2.4 免疫家兔抗S.C500特异性抗体的检测 |
| 2.5 免疫家兔T淋巴细胞增殖能力检测 |
| 2.6 免疫家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒研究 |
| 2.7 免疫家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三部分 全文总结论 |
| 第四部分 本研究的创新点 |
| 第五部分 本研究的不足之处 |
| 第六部分 本研究的展望与建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）计算机辅助HSA-hGCSF融合蛋白的分子改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 分子模拟技术 |
| 1.1.1 分子模拟技术的兴起 |
| 1.1.2 结构模拟方法 |
| 1.1.3 结构优化方法 |
| 1.2 粒细胞集落刺激因子 |
| 1.2.1 粒细胞集落刺激因子概况 |
| 1.2.2 粒细胞集落刺激因子的生物学性质 |
| 1.2.3 粒细胞集落刺激因子基因和蛋白 |
| 1.2.4 粒细胞集落刺激因子生理活性及作用机理 |
| 1.2.5 粒细胞集落刺激因子的临床应用 |
| 1.3 长效重组蛋白 |
| 1.3.1 研究背景 |
| 1.3.2 构建突变体 |
| 1.3.3 PEG 化学修饰 |
| 1.3.4 基因融合 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4.1 蛋白分泌作用 |
| 1.4.2 翻译后修饰作用 |
| 1.4.3 选择性启动子 |
| 1.4.4 基因整合方式 |
| 1.4.5 外源蛋白稳定性 |
| 1.5 立题背景及研究内容 |
| 第二章 融合蛋白的分子设计 |
| 2.1 GCSF 活性位点 |
| 2.1.1 GCSF 晶体结构 |
| 2.1.2 GCSF 活性位点 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 GCSF 结构模拟 |
| 2.3.2 HSA-GCSF 结构模拟 |
| 2.3.3 HSA-GCSF 突变体结构模拟 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 GCSF 结构模拟 |
| 2.4.2 HSA-GCSF 结构模拟 |
| 2.4.3 HSA-GCSF 突变体结构模拟 |
| 2.4.4 HSA-GCSFm 与GCSF 信号传导复合物的比较 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 表达载体PPIC9K-HSA-HGCSFM的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种与质粒 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 工具酶 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 质粒pUC57-hGCSF~m和pBlu2KSP-HSA 的提取 |
| 3.2.2 质粒pUC57-hGCSF~m和pBlu2KSP-HSA 的SauI 和NotI 消化 |
| 3.2.3 线性化pBlu2KSP-HSA 和hG-CSF~m片段的纯化 |
| 3.2.4 线性化pBlu2KSP-HSA 和hG-CSF~m片段的连接 |
| 3.2.5 DH5α感受态细胞的制备及转化 |
| 3.2.6 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF~m的鉴定 |
| 3.2.7 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF~m的序列测定 |
| 3.2.8 表达载体pPIC9K-HSA-hGCSF~m的构建 |
| 3.2.9 表达载体pPIC9K-HSA-hGCSFm的鉴定：参见3.2.6 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF~m的构建 |
| 3.3.2 重组质粒pBlu2KSP-HSA-hGCSF~m的序列测定 |
| 3.3.3 表达载体pPIC9K-HSA-hGCSF~m的构建 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 毕赤酵母工程菌的构建与表达产物鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒、细胞株 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 工具酶与试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 论文总结 |
| 一、主要结论 |
| 二、存在问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）系统性红斑狼疮患者血清BlyS水平的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 血清BlyS水平在系统性红斑狼疮中的意义 |
| 1 对象和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 |
| 综述正文 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）huGM-CSF研究现状（论文提纲范文）
| 1 huGM-CSF分子生物学研究 |
| 1.1 huGM-CSF来源 |
| 1.2 huGM-CSF基因结构及表达调控研究 |
| 1.2.1 转录水平调控研究 |
| 1.2.2 转录后水平调控研究 |
| 1.3 huGM-CSF的作用及信号转导研究 |
| 2 huGM-CSF对免疫细胞的调节作用 |
| 3 融合蛋白方面的研究 |
| 4 huGM-CSF临床应用研究 |
| 4.1 对恶性肿瘤放、化疗所致粘膜炎症、溃疡的作用 |
| 4.2 对真菌感染的治疗作用 |
| 4.3 rhuGM-CSF增强抗病毒药物疗效的研究 |
| 4.4 rhuGM-CSF促进乙肝病毒基因疫苗诱导的抗体产生 |
| 5 小结 |
四、HuGM-CSF的生物学功能及临床应用（论文参考文献）
- [1]巨噬细胞在皮肤伤口愈合过程中的调控作用及其机制研究[D]. 张婧. 西北大学, 2019(04)
- [2]当归、肉苁蓉“分子身份证”建立及太白贝母异甾体类生物碱合成相关基因挖掘[D]. 王晓玥. 北京协和医学院, 2019(02)
- [3]人促甲状腺激素受体抗体定量荧光酶免法的建立及临床应用[D]. 李宁. 天津医科大学, 2011(04)
- [4]犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测[J]. 刘杰,蒋成砚,胡俊杰,全舒舟,雷泉. 黑龙江畜牧兽医, 2011(07)
- [5]奶牛GM-CSF的克隆、表达、活性检测与乳房炎治疗试验[D]. 傅军科. 石河子大学, 2009(03)
- [6]BLyS及受体BAFF-R水平在类风湿关节炎中的意义[D]. 李媛. 天津医科大学, 2009(12)
- [7]含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用[D]. 韩国全. 四川农业大学, 2009(07)
- [8]计算机辅助HSA-hGCSF融合蛋白的分子改造[D]. 朱书峰. 江南大学, 2008(03)
- [9]系统性红斑狼疮患者血清BlyS水平的研究[D]. 孔纯玉. 天津医科大学, 2008(01)
- [10]huGM-CSF研究现状[J]. 王传生,王庆林. 湖南师范大学学报(医学版), 2005(04)