一、牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析（论文文献综述）
阮谦,刘应华,赵谦,王蕾,尹革芬[1]（2020）在《牛流行热病毒荧光定量PCR检测方法的建立》文中研究说明鉴于牛流行热（BovineEphemeralFever,BEF）对养牛行业的危害以及荧光定量PCR技术高效、快速、精准的优点,本研究针对牛流行热病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus,BEFV）G基因建立荧光定量PCR检测方法。并用所建立的荧光定量PCR检测方法对临床采集的样本进行检测。结果显示:在GenBank数据库中对BEFV全基因组序列进行比对分析,找出保守序列,设计1对扩增BEFV G基因片段的引物,通过分子克隆构建重组质粒制备标准曲线,扩增效率是95.1%,用所建立的方法检测临床样本,阳性15份,阳性率为75%。该试验成功建立了检测BEFV的荧光定量PCR检测方法,证明云南省的牛场中广泛存在BEFV,建立的荧光定量PCR检测方法对BEFV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。
高闪电,王积栋,独军政,郑福英,田占成,殷宏[2]（2018）在《牛流行热病毒分离株HN1/2012的全基因组序列测定及演化分析》文中进行了进一步梳理旨在解析我国牛流行热病毒（BEFV）分离株HN1/2012的基因组特征,为阐明我国BEFV毒株的演化规律提供数据。根据GenBank中收录的BEFV毒株的全基因组信息,设计引物,以RT-PCR扩增11段相互部分重叠的DNA片段,克隆至pGEM T-easy载体,分别进行测序,利用DNAStar软件进行序列拼接获得HN1/2012株的全基因组序列。根据BEFV编码基因的转录起始（TI）和转录终止/多聚腺苷酸化（TTP）序列分析获得各基因序列及其开放阅读框（ORF）,与参考毒株比对序列相似性,并以G基因序列构建系统发生树,分析其遗传演化关系。结果显示:HN1/2012株基因组全长为14 899nt,包含前导序列（50nt）、N基因（1 328nt）、P基因（858nt）、M基因（691nt）、G基因（1 896nt）、GNS基因（1 785nt）、α1α2基因（638nt）、β基因（459nt）、γ基因（400nt）、L基因（6 470nt）和尾随序列（70nt）。病毒9个基因分别由26、43、47、53、37、39、30、-21nt的基因间隔区（IGR）连接。在全基因组水平,HN1/2012株与我国2002年浙江分离株JT02L的相似性最高,但G基因与同期分离株LYC11、LS11相似性最高。重组分析表明HN1/2012株未发生基因重组。HN1/2012株的演化可能与免疫选择压力导致的基因突变有关。本研究测定了HN1/2012株的基因组序列,为我国BEFV分离株的全基因组分子演化研究奠定了基础。
李志[3]（2015）在《牛流行热两种ELISA诊断技术的建立与应用》文中进行了进一步梳理牛流行热（bovine ephemeral fever,BEF）是由牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus）引起的一种牛的非接触性的虫媒病毒性疾病,该病引起牛的高热、流产,役用牛跛行和瘫痪,奶牛的产奶量下降,对养殖业造成重大损失。BEFV编码有5种结构蛋白和其他未知功能的蛋白,其中G蛋白是主要的免疫原性蛋白,其表面存在4个抗原位点,G1为BEFV所特有,且G1抗原位点在BEFV中很保守。目前,国内外均没有商品化的诊断BEFV或其抗体的试剂盒。另外,在国内外检测牛流行热病毒或其抗体的方法,有RT-PCR、LAMP、实时荧光定量PCR、微量中和试验等方法,但是这些方法几乎没有用于临床样品的筛查,这些检测方法需要昂贵的实验设备、试剂、耗材以及专业的技术人员,不适于野外样品的调查,无法广泛的应用于基层和大规模的流行病学调查。本研究对包含部分抗原表位的BEFV G1基因片段进行克隆表达、纯化,进行反应原性和特异性分析,最后以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测BEFV抗体间接ELISA诊断方法,并且成功开发了试剂盒,对中国部分地区2822份血清进行流行病学调查。同时,本研究也针对BEFV的免疫保护基因G基因的G1抗原表位,合成单克隆抗体,作为包被抗体（捕获抗体）,以抗BEFV的高免血清（多克隆抗体）作为追踪抗体,建立了检测牛流行热病毒抗原的抗原捕获ELISA方法,并且对200份野外的全血样品对其进行了评价。研究结果如下:1.以本实验室保存的BEFV（LYC11株）的G基因质粒为模板,根据GenBank上登录的BEFV（LYC11株）全病毒基因组序列设计特异性引物,通过PCR扩增得到包含G1基因的DNA片段,经测序验证后,用原核表达系统进行表达,经过反应原性和特异性分析,证明该重组蛋白具有很好的反应原性,只与抗BEFV的抗体进行反应。2.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了检测BEFV抗体的间接ELISA方法,并且对该方法进行优化,开发了BEFV抗体检测间接ELISA试剂盒,使其可以稳定的应用于临床样品的检测。3.以开发的试剂盒对我国26个省份的2822份血清进行了检测,BEFV抗体的阳性率为0%-81%,并且对血清学调查结果进行了详细的讨论。4.针对根据GenBank登录的BEFV（LYC11株）G1基因序列合成了抗-G1抗原位点的单克隆抗体,并且对其反应性和特异性进行评估,结果证明,该单克隆抗体具有良好的反应性和特异性,并对其效价进行评估。5.以合成的单克隆抗体和多克隆抗体分别为捕获抗体和追踪抗体,建立了检测BEFV抗原的抗原捕获ELISA方法,利用200份临床样品对该方法进行进一步评价,成功建立了检测BEFV抗原的AC-ELISA方法。
朱庆虎,陈弘,刘兰刚,秦红丽,康二勇[4]（2011）在《牛流行热免疫学浅析》文中研究说明牛流行热又称暂时热、三日热、僵硬病或流行性感冒。是由牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus,BEFV）引起的牛的一种急性、热性和高度接触性传染病。该病病原为BEFV,弹状病毒科暂时热病毒属成员。病毒粒子呈子弹形或圆锥状,成熟病
郑福英[5]（2007）在《牛流行热病毒糖蛋白G1抗原表位的表达及重组G1蛋白抗原间接ELISA方法的建立》文中指出牛流行热（bovine ephemeral fever，BEF）是由牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）引起的一种急性传染病，首先发现于19世纪中期的东非，随后流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区。该病传播迅速，流行面广，有一定的周期性，曾在我国多个省份多次发生，导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成重大经济损失。BEFV有5种结构蛋白，其中G蛋白是主要的免疫原性蛋白，其表面存在5个抗原位点，G1为BEFV所特有，只与牛流行热病毒阳性血消发生反应，而其它位点与同科的相关病毒则存在交叉反应，因此我们选取G1抗原表位进行克隆表达和蛋白纯化。将得到的重组G1蛋白作为包被抗原，建立检测BEF血清抗体的间接ELISA方法，开发相关的试剂盒，为该病的快速诊断和疫苗免疫后的抗体水平监测提供技术支持。本研究从BEF中国标准毒株JB76H株中提取总RNA，通过RT-PCR方法扩增G1抗原表位目的基因。序列分析发现，克隆的G1抗原表位基因与NCBI／GenBank上登载的台湾株的核苷酸同源性为96.4％，氨基酸同源性为96.5％；与澳大利亚株的核营酸同源性为89.1％，氨基酸同源性为90.8％。目的基因在GS115中得到胞外分泌的可溶性目的篮白，蛋白大小约为26.0kDa；在BL21（DE3）中得到主要以包涵体形式存在的重组蛋白，蛋白大小约为41.54kDa。经SDS-PAGE、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析，两种蛋白均具有良好的反应原性、免疫原性和特异性，可作为包被抗原，建立ELISA方法。以BL21（DE3）表达的重组蛋白作为包被抗原，经过各种反应条件的优化，建立了检测BEFV血清抗体的间接ELISA方法。本研究表明，抗原的最适包被浓度为0.574μg／孔；血清和酶标抗体的最佳稀释度分别为1：20和1：200；抗原包被后以37℃1h转入4℃过夜包被效果较好；封闭后以37℃1h、血清加入后以37℃1h、酶标抗体加入后以37℃1h反应，为ELISA最适反应温度和间隔时间。判定标准为：标准阴性血清对照孔OD490值的平均值×2.1作为闽值，所测样品的OD490值大于或等于阈值判为阳性，小于阈值判为阴性。该法有良好的敏感性、特异性和重复性，有临床实用价值。在毕赤酵母GS115中表达的可溶性目的蛋白作为包被抗原，也建立了间接ELISA方法。该方法敏感性和重复性较好，但特异性和符合性较差，其根本原因是目的蛋白纯度较低，必须有行之有效的纯化方法，该蛋白才有应用价值。本试验对ELISA试剂盒的开发作了初步研究。确定了试剂盒的组成成分，其保存条件、保存期、特异性、敏感性、符合性以及批内和批间的稳定性都有了可靠的检验数据，有望开发成可上市的试剂盒。
李继昌[6]（2002）在《牛传染性鼻气管炎重组疫苗的基础研究》文中研究指明牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由Ⅰ型牛疱疹病毒（bovine berpesvirus-1，BHV-1）引起牛的一种以上呼吸道炎症为主的接触性传染病，临床表现多种多样，以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱为主要特征。BHV-1基因组为138kb的线性双股DNA分子，分成长独特区（UL，106kb）和短独特区（Us，10kb），后者被两个反向重复序列（IRs，TRs各为11kb）隔开，重复序列变异性较大。立即早期基因IER4.2就位于其中，编码与单纯疱疹病毒（HSV-1）ICP4同源的转录调控蛋白BICP4。各种疱疹病毒ICP4的Ⅱ和Ⅳ区高度保守，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ区同源性较低。为了比较不同病毒株重复序列的差异性，根据已发表的BHV-1 K22毒株重复序列IRs中BICP4的基因序列设计了一对特异性引物，以BICP4 Ⅰ区中部分序列为靶标，对分离自不同牛种、不同部位的洛精株、美精株、B7株、V125株和BarthaNu／67株BHV-1基因组进行PCR扩增，均得到约540bp的片段，将其克隆、测序并与K22株进行同源性比较。结果显示，六株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在98％以上，表明本实验所分离的这些毒株重复序列中的早期基因高度保守，在一定程度上显示出BHV-1的相对保守性。 糖蛋白gD是BHV-1的主要结构蛋白和免疫保护性抗原之一，在致病和免疫机制中发挥着重要作用。洛精株是从我国洛阳种牛场西门塔尔牛精液中分离的IBRV。本文根据已发表的BItV-1 P8-2毒株gD糖蛋白基因的核苷酸序列设计了一对特异性引物，对洛精株IBRV gD基因进行PCR扩增、克隆和测序。序列分析结果表明，本实验已成功地获得了BI-IV-1洛精株gD全基因序列，共1251bp，编码417个氨基酸残基。序列比较分析结果显示，IBRV洛精株的gD基因核苷酸序列与国外发表的BHV-1 P8-2株gD基因序列只有一个核苷酸碱基的差异，其同源性高达99.92％，所编码氨基酸的同源性为100％，即该碱基的突变并未引起氨基酸的变化。由此表明了BHV-1 gD基因的高度保守性。 鉴于gD糖蛋白基因的高度保守性及良好的免疫原性，可用其作为靶抗原构建重组表达质粒，有望用于生产有潜力的亚单位疫苗或基因疫苗。本研究将已获得的IBRV gD基因再亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中，获得重组质粒pcDNA-gD。将此表达质粒单独或连同脂质体免疫BALB／c小鼠，用ELISA法检测血清抗体水平。结果表明，含IBRV gD基因的表达质粒单独注射及连同脂质体混合注射的小鼠均可检测到特异性抗体，且后者强于前者，而对照组无此反应。本试验为探讨我国IBRV分离株的生物学特性及进一步研制基因疫苗提供了理论和实验基础。 用活病毒作为载体表达其它病原的保护性抗原基因为改进现有的常规疫苗提供了契机，成为疫苗学很有发展前景的领域之一。国外已有用BHV-1作为载体表达其它病毒保护性基因的成功先例。本研究将IBRV LA株DNA HindⅢ A片段中的SaiⅠ-SalⅠ亚片段李继昌 牛传染性鼻气管炎重组疫苗的基础研究2002年5月 （含 TK基因）克隆到质粒pBluescript SK中，再用 Bglll和 Sacl切去 347be，获得含TK基因部分缺失的重组质粒pdTK，然后用Hindlll和Xbal切去其中的多克隆位点；将来源于PCR3－Ufli的p启动子、多克隆位点和BGH POlyu)信号尾插入PdTK质粒的XhOI位点上，构建了通用IBRV转移载体pdTKod，可用来表达其它牛呼吸道病毒基因，如牛副流感病毒（BPIV3）、牛呼吸道综合症病毒（BRSV）和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等，从而开辟一条开发利用BHV－二载体资源的途径。 牛流行热是由牛流行热病毒（BEFV）引起牛的急性热性传染病。感染牛表现为急性发热、呼吸道和消化道机能障碍以及踱行和肢体僵直。外膜糖蛋白G基因位于病毒表面并含有中和抗原表位，可使牛产生免疫保护力。本试验将克隆到 pBluescript SK中的BEFV G基因亚克隆到含有 p启动于和 POly（A）信号尾的批R3Allli载体上，获得 PTA－－G重组质粒，用Haed酶切后将含有CMV、G蛋白基因和Polyu)的目的片段（大约3．6Kb）插入通用转移载体PdTtw中，获得10．ZKb大小的PdTK－－CMBAI重组质粒；再将含SV40启动子的LacZ报告基因也亚克隆到该载体获得ndTKthacZ－－G转移载体。通过脂质体方法转染由 IBRV Bartha株感染的 MDBK细胞，筛选蓝色蚀斑进行重组病毒的蚀斑纯化。通过PCR方法鉴定证明该重组病毒基因组中含有完整的牛流行热病毒G蛋白基因，为下一步制备 IBRV／BEFV二价基因工程疫苗，以及基于此的多价疫苗奠定了基础。 总之，本研究对牛传染性鼻气管炎病毒部分重复序列进行了同源性分析，首次克隆和测定了我国IBRV洛精株gD基因的核昔酸序列，又构建了gD真核表达质粒，接种小鼠能诱导免疫抗体反应，并构建了 IBRV通用转移载体和 BEFV gG重组 IBRV，为揭示 IBRV的流行病学及研制新型疫苗提供了重要依据。
李媛[7]（2001）在《牛流行热病毒JB76H株G蛋白及牛白细胞介素-2基因在重组痘苗病毒中的表达》文中提出牛流行热（Bovine ephemeral fever，BEF）是由牛流行热病毒（Bovine ephemeral fever virus，BEFV）引起的牛和水牛的急性热性传染病。它广泛流行于亚洲、非洲和大洋洲许多国家和地区。本病的死亡率较低，大部分发病牛均能康复，但由于发病率高，对于奶牛产奶量和役牛使役能力有极大的影响，给养牛业造成巨大的经济损失。BEFV属弹状病毒科暂时热病毒属（Ephemeral virus）成员，共有5个结构蛋白，其中G蛋白是BEFV主要免疫原性蛋白。以G蛋白制成的亚单位疫苗免疫牛，可使牛产生对强毒的抵抗力。因而，G蛋白基因是构建BEFV基因工程疫苗的首选基因。 白细胞介素-2（IL-2）是由辅助性T淋巴细胞（Helper T cell）分泌的一种T细胞生长因子，具有许多生物活性。以重组IL-2作为免疫增强剂可能是解决目前众多疫苗效果不良或不稳定问题的有效途径之一，是被人们普遍看好并有着广阔应用前景的新型佐剂。 为研制BEFV基因工程疫苗，我们首先人工合成了痘苗病毒强启动子PE/L，并构建了含痘苗病毒强启动子转移质粒载体pSCPE/L，与pSCll相比，pSCPE/L不仅具有较强的调控外源基因的表达能力，而且由于在pSCPE/L中引入了多克隆位点，使其在构建重组转移载体时更加方便。我们共获得两株重组痘苗病毒，一株是表达BEFV的主要免疫原性糖蛋白G基因的重组痘苗病毒rVVPE/LG，另一株为同时表达G基因和牛IL-2全基因（sIL-2）的双重组痘苗病毒rVVPE/LGsIL2，并对G蛋白和IL-2在重组病毒中的蛋白表达情况进行了初步研究。主要内容如下： 首先以RT-PGR法扩增并克隆了BEFV中国分离株（JB76H）中的主要免疫原性糖蛋白G基因并进行了脱氧核糖核苷酸序列分析，发现G蛋白基因中存在的T5CT序列对痘苗病毒P7.5启动子具有终止信号的功能。为解决这一问题，本研究人工合成了强启动子PE/L，取代了痘苗病毒转移载体pSCll中的P7.5启动子，构建了新的痘苗病毒转移载体pSCPE/L，将G基因插入PE/L下游，构建了重组痘苗病毒转移载体质粒pSCPE/LG。pSCPE/L的另一启动子P11调控报告基因LacZ的表达，我们用sBoIL-2基因取代LacZ，构建了可同时表达G基因和sBoIL-2基因的另一株重组质粒。将上述2株质粒进行了转染，通过筛选，得到了重组病毒，并对蛋白的表达水平进行了检测。SDS-PAGE结果表明，在PE/L的调控下，重组痘苗病毒成功表达了G蛋白基因，不仅糖基化水平与天然G蛋白相近，而且表达效率很高；在P11启动子调控下，BosIL-2基因也得到了表达。MTT比色法的结果表明，双重组病毒rVVPE/LGsIL2表达的IL-2对Con A活化的PBM具有良好的维持体外生长和繁殖的作用。 兔体免疫实验的结果表明，两种重组痘苗病毒表达的G蛋白诱导兔体产生中和抗硕士学位论文 拓 要2001年11月体的速率和效价均高于传统油苗免疫，证明重组痘苗病毒具有作为牛流行热病毒重组痘苗病毒的潜能。其中双重组病毒rVyP。。GsILZ 的中和抗体水平又高于单重组病毒rVVP。、G。本实验构建的重组痘苗病毒为今后以此为工具，研制BEFV重组痘苗病毒活载体疫苗和探讨几－2对活载体疫苗的免疫增强作用奠定了基础。
金红[8]（2000）在《牛流行热病毒外膜糖蛋白G基因在重组病毒中的表达研究》文中研究说明牛流行热是由病毒引起牛和水牛的急性热性传染病。它广泛流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区。为了解牛流行热病毒中国分离株（BEFV JB76H）主要免疫原性糖蛋白G基因的分子生物学特性，以及在重组痘苗病毒和杆状病毒中的表达情况，研究制备BEFV JB76H基因工程疫苗的可行性，进行了本研究。本研究首次以RT-PCR法扩增并克隆了BEFV JB76H主要免疫原性糖蛋白G基因，并进行了脱氧核糖核苷酸序列分析。结果表明，中国分离株G蛋白基因与澳大利亚分离株之间的同源性为91％。说明我国分离株与澳大利亚分离株之间存在较大差异，这可能是由于地域的不同造成牛流行热病毒的变异。利用重组病毒技术，构建了中国分离株G蛋白基因重组痘苗病毒和杆状病毒。结果表明，G蛋白基因中存在的T5CT序列对痘苗病毒P7.5启动子具有终止信号的功能。这一序列的存在导致G蛋白基因几乎不能在天然痘苗病毒P7.5启动子的调控下，在重组痘苗病毒中得到完全表达。动物免疫实验结果表明，使用P7.5启动子的重组痘苗病毒，不能诱导动物产生具有保护效力的中和抗体。为解决这一问题，本研究构建了人工合成强启动子PE/L重组痘苗病毒转移载体，并首次在重组痘苗病毒中采用人工合成强启动子PE/L，成功表达了G蛋白基因。结果表明，在人工合成强启动子PE/L的调控下，由重组痘苗病毒表达的G蛋白基因不仅糖基化水平与天然G蛋白相近，而且表达效率大大提高。对兔子的免疫结果表明，该重组痘苗病毒表达的G蛋白诱导兔子产生中和抗体的速率和效价均高于传统油苗免疫，证明该重组痘苗病毒具有作为牛流行热病毒重组痘苗病毒的潜能。本实验首次成功构建了G蛋白重组杆状病毒。结果表明，重组杆状病毒表达的G蛋白具有牛流行热病毒G蛋白的抗原特异性和免疫原性。另外，本研究探讨研究了牛流行热病毒、痘苗病毒和油苗免疫后对牛外周血淋巴细胞亚类分布的影响。结果显示，这些因素的作用均能导致牛外周血淋巴细胞中CD4+细胞含量的升高。这一结果为研究牛流行热病毒免疫机制提供了一个重要的参考数据。
金红,李媛,于康震,严隽端,刘宝全[9]（2000）在《牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析》文中认为通过反转录聚合酶链反应（RTPCR）,从中国北京分离株牛流行热病毒JB76H 基因组RNA中扩增出主要保护性抗原糖蛋白G的cDNA。采用Sanger’s 双脱氧末端终止法测定cDNA 片段的核苷酸序列,并推导出氨基酸序列。G基因全长为1872 个碱基,单一的开放阅读框架编码623 个氨基酸的多肽。将测得的序列与澳大利亚六个分离株进行比较,发现我国分离株与澳大利亚分离株间同源性为91% ,低于澳大利亚各分离株之间的同源性（98% ～99% ） 。同时氨基酸序列比较结果也显示,我国分离株与澳大利亚分离株间同源性（93.9% ）低于澳大利亚各分离株之间的同源性（96% ～98 %） 。说明我国牛流行热毒株与澳大利亚毒株亲缘关系较远
金红,李媛,于康震,严隽端,刘宝全[10]（1999）在《牛流行热病毒结构糖蛋白（G）基因的克隆及鉴定》文中研究表明牛流行热是由病毒引起的牛和水牛的急性热性传染病。其G蛋白为81kDa的结构糖蛋白，它位于病毒表面并含有中和抗原位点，可使牛产生免疫保护。本研究利用RT-PCR法从牛流热病毒北京血毒JB76H总RNA中，扩增并克隆了其G蛋白基因（1.9Kb）。限制性内切酶酶切分析结果显示，与澳大利亚分离株BB7721差异较大。脱氧核糖核苷酸序列分析表明，该基因与澳大利亚分离株BB7721同源性高达91％。
二、牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析（论文提纲范文）
（1）牛流行热病毒荧光定量PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样本采集 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 引物设计 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 BEFV RNA的提取 |
| 1.2.2 反转录及荧光定量PCR |
| 1.2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 1.2.4 临床样本的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的片段的扩增鉴定 |
| 2.2 构建BEFV荧光定量PCR的标准曲线 |
| 2.3 临床样本检测 |
| 3 讨论 |
（2）牛流行热病毒分离株HN1/2012的全基因组序列测定及演化分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 RNA提取 |
| 1.5 RT-PCR和基因克隆 |
| 1.6 基因组序列、基因结构及演化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR扩增 |
| 2.2 克隆鉴定和测序 |
| 2.3 基因组结构分析 |
| 2.4 基因组变异分析 |
| 2.5 系统进化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（3）牛流行热两种ELISA诊断技术的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 发病历史 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 病原学 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 诊断 |
| 1.7 防控 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第2章 牛流行热病毒糖蛋白的原核表达与抗原性分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验动物和阳性血清 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因引物的设计和合成 |
| 2.2.2 目的基因的克隆和鉴定 |
| 2.2.3 重组表达载体的构建和鉴定 |
| 2.2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.5 阳性血清制备 |
| 2.2.6 目的蛋白的表达、纯化以及生物活性鉴定 |
| 2.2.7 ELISA特异性试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3.2 目的蛋白的SDS-PAGE |
| 2.3.3 目的蛋白的抗原性鉴定 |
| 2.3.4 ELISA特异性实验 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 牛流行热病毒间接ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 抗原的制备 |
| 3.1.4 血清的采集 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 微量中和实验 |
| 3.2.2 间接ELISA程序 |
| 3.2.3 间接ELISA方法最佳反应条件的选择 |
| 3.2.4 间接ELISA特异性、敏感性的测定 |
| 3.2.5 间接ELISA Cut-Off值的确定 |
| 3.2.6 交叉反应实验 |
| 3.2.7 间接ELISA方法对临床样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 微量中和实验 |
| 3.3.2 间接ELISA方法最佳反应条件的选择 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 牛流行热病毒抗体检测间接ELISA试剂盒的研发 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂盒的组成 |
| 4.1.4 试剂盒保存条件 |
| 4.1.5 试剂盒使用注意事项 |
| 4.1.6 试剂盒的使用说明 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 试剂盒敏感性和特异性的检测 |
| 4.2.2 试剂盒保存期及稳定性检测 |
| 4.2.3 试剂盒批内(同一批次)和批间(不同批次)的稳定性检测 |
| 4.2.4 试剂盒的的应用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 试剂盒敏感性和特异性的评价 |
| 4.3.2 试剂盒保存期及稳定性评价 |
| 4.3.3 试剂盒批内和批间的稳定性评价 |
| 4.3.4 试剂盒的推广与应用 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 牛流行病毒的血清学调查 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 抗原捕获ELISA方法的建立 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 病毒和样品 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 多克隆抗体（牛高免血清）的制备 |
| 6.2.2 抗-G1单克隆抗体的制备 |
| 6.2.3 AC-ELISA方法的建立 |
| 6.2.4 AC-ELISA方法特异性和敏感性的评价 |
| 6.2.5 动物实验 |
| 6.2.6 临床样品的调查 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 多克隆抗体的制备 |
| 6.3.2 单克隆抗体的制备 |
| 6.3.3 AC-ELISA方法条件的优化 |
| 6.3.4 AC-ELISA方法特异性和敏感性的评价 |
| 6.3.5 AC-ELISA方法对实验感染黄牛BEFV的检测 |
| 6.3.6 临床样品的调查 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）牛流行热免疫学浅析（论文提纲范文）
| 1 宿主范围 |
| 2 病毒基因组及结构蛋白 |
| 3 抗原性及血清型 |
| 4 抗原位点变异 |
| 5 病理损伤及免疫应答 |
| 6 防制与展望 |
（5）牛流行热病毒糖蛋白G1抗原表位的表达及重组G1蛋白抗原间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究的目的和意义 |
| 1.2 研究历史概述 |
| 1.3 病原 |
| 1.4.流行病学 |
| 1.5 诊断 |
| 1.6 BEF的免疫与防制 |
| 第二章 BEFV糖蛋白(G)基因的克隆 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 G_1抗原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 G_1抗原表位基因在大肠杆菌中的表达、纯化及抗原性鉴定 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 大肠杆菌表达重组G_1蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 毕赤酵母表达重组G_1蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 BEFV G_1-ELISA诊断试剂盒的初步研制 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）牛传染性鼻气管炎重组疫苗的基础研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1. 牛传染性鼻气管炎病的研究进展 |
| 2. 病毒活载体疫苗的研究进展 |
| 3. 基因疫苗的研究进展 |
| 实验研究 |
| 1. 牛传染性鼻气管炎病毒部分重复序列的同源性分析 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 毒株 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 病毒培养及核酸提取 |
| 1.1.6 引物设计 |
| 1.1.7 PCR扩增 |
| 1.1.8 PCR产物的克隆与鉴定 |
| 1.1.9 目的基因的序列测定与同源性分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 目的基因的PCR扩增、克隆及重组质粒的初步鉴定 |
| 1.2.2 目的基因的序列测定与同源性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 2. 牛传染性鼻气管炎病毒gD基因表达质粒的构建及对小鼠的免疫反应 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒和质粒 |
| 2.1.2 病毒培养及核酸提取 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 gD基因的PCR扩增及产物的酶切鉴定 |
| 2.1.6 IBRV gD基因PCR产物的克隆与鉴定 |
| 2.1.7 IBRV gD基因的序列测定与分析 |
| 2.1.8 IBRV gD表达质粒的构建 |
| 2.1.9 真核表达质粒的大量制备及纯化 |
| 2.1.10 实验动物分组及免疫 |
| 2.1.11 抗原的制备及抗体检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 IBRV洛精株gD基因的PCR扩增及鉴定 |
| 2.2.2 IBRV gD基因的克隆及重组质粒的初步鉴定 |
| 2.2.3 洛精株IBRV gD基因的序列及其分析 |
| 2.2.4 IBRV洛精株gD真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.5 血清抗体检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3. 牛传染性鼻气管炎病毒通用转移载体的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 主要工具酶 |
| 3.1.4 主要试剂和仪器 |
| 3.1.5 重组质粒pdTK-CMB的构建 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4. 表达BEFV G蛋白基因的IBRV重组病毒的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 质粒 |
| 4.1.2 病毒和细胞 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 细胞培养、蚀斑纯化所用试剂 |
| 4.1.5 BEFV G基因的IBRV转移载体的构建 |
| 4.1.6 pdTK-LacZ-G转移载体质粒的纯化 |
| 4.1.7 细胞培养及IBR病毒的增殖 |
| 4.1.8 重组病毒的构建及筛选 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 BEFV G基因的IBRV转移载体的构建 |
| 4.2.2 病毒的构建及筛选 |
| 4.2.3 组病毒的PCR鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）牛流行热病毒JB76H株G蛋白及牛白细胞介素-2基因在重组痘苗病毒中的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 综述 |
| 1. 牛流行热病研究概况 |
| 2. 痘苗病毒载体的研究进展 |
| 3. 重组白细胞介素-2（rIL-2）的研究进展 |
| 材料与方法 |
| 1. 病毒、细胞和实验动物 |
| 2. 载体、酶、试剂盒 |
| 3. BEFV G蛋白的RT-PCR扩增 |
| 4. BEFV JB76H G蛋白基因的克隆 |
| 5. 带有信号肽的牛白细胞介素-2基因的克隆 |
| 6. 重组痘苗病毒转移质粒载体pSCP_（E/L）的构建 |
| 7. BEFV G基因单重组及其与BoIL-2基因双重组痘苗病毒转移载体的构建 |
| 8. 表达G蛋白基因和BoIL-2基因的重组痘苗病毒的构建 |
| 9. 重组痘苗病毒中G蛋白和sBoIL-2的表达检测 |
| 10. 重组病毒的兔体免疫实验 |
| 结果 |
| 1. EFV G蛋白的RT-PCR扩增条件的建立 |
| 2. BEFV JB76HG蛋白基因的克隆 |
| 3. 带有信号肽的牛白细胞介素-2的克隆 |
| 4. 含强启动子P_（E/L）的痘苗病毒转移载体pSCP（E/L）G的构建 |
| 5. BEFV G蛋白与BoIL-2双重组痘苗病毒转移载体的构建 |
| 6. 表达G蛋白基因和BoIL-2基因的重组痘苗病毒的构建 |
| 7. 重组痘苗病毒中BEFV G蛋白和sBoIL-2蛋白的表达检测 |
| 8. 重组病毒的兔体免疫实验 |
| 讨论 |
| 1 BEFV JB76H G蛋白基因的RT-PCR扩增和克隆 |
| 2 BEFV JB76H G蛋白基因核苷酸序列分析 |
| 3 sBoIL-2的克隆 |
| 4 含痘苗病毒强启动子P（E/L）的转移载体质粒pSCP（E/L）的构建 |
| 5 含BEFVG基因与含G基因与BoIL-2基因的重组痘苗病毒转移载体的构建 |
| 6 表达G基因和BOIL-2基因的重组痘苗病毒的构建 |
| 7 重组痘苗病毒中BEFV G蛋白和sBoIL-2蛋白的表达检测 |
| 8 重组病毒的兔体免疫实验 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）牛流行热病毒外膜糖蛋白G基因在重组病毒中的表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前 言 |
| 综 述 |
| 1. 牛流行热病研究概况 |
| 2. 外源基因在重组痘苗病毒中的表达及其在免疫中的应用与安全性 |
| 材料与方法 |
| 1. 病毒和细胞 |
| 2. 细菌和质粒载体 |
| 3. BEFV JB76H的培养及病毒RNA的提取与纯化 |
| 4. BEFV JB76H G蛋白基因的RT-PCR扩增 |
| 5. BEFV JB76H G蛋白基因的克隆 |
| 6. BEFV JB76H G蛋白基因限制性内切酶酶谱分析 |
| 7. BEFV G蛋白基因脱氧核糖核苷酸序列的测定与分析 |
| 8. BEFV JB76H G蛋白基因重组痘苗病毒的构建 |
| 9. 重组痘苗病毒中BEFV JB76H G蛋白的表达检测 |
| 10. BEFV JB76H G蛋白基因重组杆状病毒的构建 |
| 11. BEFV JB76H G蛋白基因重组杆状病毒中G蛋白的表达检测 |
| 12. 重组杆状病毒表达的BEFV JB76H G蛋白抗原性检测分析 |
| 13. 重组病毒的兔体免疫实验 |
| 14. 牛外周血淋巴细胞亚类的分布研究 |
| 结果与分析 |
| 1. EFV JB76H糖蛋白G基因RT-PCR扩增条件的建立 |
| 2. BEFV JB76H G蛋白基因克隆载体的构建及重组质粒鉴定 |
| 3. BEFV JB76H G蛋白基因痘苗病毒转移载体的构建 |
| 4. BEFV JB76H G蛋白基因重组痘苗病毒的构建 |
| 5. 免疫印迹法检测重组痘苗病毒中BEFV JB76H G蛋白基因的表达 |
| 6. BEFV JB76H G蛋白基因重组杆状病毒的构建 |
| 7. SDS-PAGE法检测重组杆状病毒中G蛋白的表达 |
| 8. 重组杆状病毒表达的BEFV JB76H G蛋白抗原性分析 |
| 9. 重组病毒的兔体免疫实验结果 |
| 10. 牛外周血淋巴细胞亚类的分布研究 |
| 讨 论 |
| 1. BEFV JB76H G蛋白基因的克隆及脱氧核糖核苷酸序列分析 |
| 2. BEFV JB76H G蛋白基因在重组痘苗病毒中的表达研究 |
| 3. BEFV JB76H G在杆状病毒中的表达 |
| 4. 牛外周血淋巴细胞亚类的分布研究 |
| 结 论 |
| 参考文献 |
| 致 谢 |
| 作者简历 |
（9）牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒、菌株和载体质粒 |
| 1.1.1 病毒: |
| 1.1.2 菌种和质粒: |
| 1.2 BEFVG蛋白基因的克隆 |
| 2 结果和讨论 |
| 2.1 G基因核苷酸序列测序结果 |
| 2.2 G基因氨基酸序列比较 |
| 2.3 G蛋白中和抗原位点的氨基酸序列比较分析 |
四、牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析（论文参考文献）
- [1]牛流行热病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 阮谦,刘应华,赵谦,王蕾,尹革芬. 国外畜牧学(猪与禽), 2020(11)
- [2]牛流行热病毒分离株HN1/2012的全基因组序列测定及演化分析[J]. 高闪电,王积栋,独军政,郑福英,田占成,殷宏. 畜牧兽医学报, 2018(10)
- [3]牛流行热两种ELISA诊断技术的建立与应用[D]. 李志. 新疆农业大学, 2015(06)
- [4]牛流行热免疫学浅析[J]. 朱庆虎,陈弘,刘兰刚,秦红丽,康二勇. 畜牧兽医科技信息, 2011(01)
- [5]牛流行热病毒糖蛋白G1抗原表位的表达及重组G1蛋白抗原间接ELISA方法的建立[D]. 郑福英. 中国农业科学院, 2007(05)
- [6]牛传染性鼻气管炎重组疫苗的基础研究[D]. 李继昌. 东北农业大学, 2002(02)
- [7]牛流行热病毒JB76H株G蛋白及牛白细胞介素-2基因在重组痘苗病毒中的表达[D]. 李媛. 东北农业大学, 2001(01)
- [8]牛流行热病毒外膜糖蛋白G基因在重组病毒中的表达研究[D]. 金红. 东北农业大学, 2000(01)
- [9]牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析[J]. 金红,李媛,于康震,严隽端,刘宝全. 中国预防兽医学报, 2000(01)
- [10]牛流行热病毒结构糖蛋白（G）基因的克隆及鉴定[J]. 金红,李媛,于康震,严隽端,刘宝全. 中国预防兽医学报, 1999(06)