一、山东地区TTV检测和部分基因克隆及序列测定（论文文献综述）
干射香[1]（2020）在《CCYV山东黄瓜分离物基因组结构特征及致病相关蛋白研究》文中研究说明黄瓜（Cucumis sativus）是我国重要的设施蔬菜作物之一,其营养价值丰富,经济价值较高,在丰富居民菜篮子、满足蔬菜周年供应、农村致富及农民增收中起着重要作用。但是近年来随着耕作模式的调整及环境的变化黄瓜上的病毒病呈现多发常发态势,给黄瓜作物安全生产造成了严重的困扰。瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）是一种侵染危害多种瓜类作物的粉虱传植物病毒,该病毒自2010年传入我国以来,给多个省市的甜瓜、西瓜、黄瓜等作物生产造成了严重的损失。2016年,我们在对山东寿光等地黄瓜上病毒病进行调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间采集病样进行了分子检测,结果从中检测到了瓜类褪绿黄化病毒,进一步的CP基因克隆及序列分析也证实了这一结果,这是该病毒在山东侵染黄瓜的首次报道,山东一方面是我国重要的蔬菜生产基地,CCYV的发生可能会给当地黄瓜生产造成严重的威胁,另一方面山东亦是全国重要的种苗基地,全国范围的种苗调运极有可能进一步加剧CCYV在更大范围的扩散蔓延,因此该病害在黄瓜上的危害值得密切关注。为进一步明确该分离物的特征及分类地位,为后续研究该病毒致病机理奠定基础。本研究通过分段法对CCYV的基因组进行了克隆,序列测定后拼接获得CCYV山东分离物基因组（RNA1和RNA2）序列信息。序列分析结果显示其基因组RNA1全长8,607 bp,RNA2全长8,041 bp,共编码12个蛋白;序列同源性比对分析结果显示其与已报道的CCYV其它分离物高度同源,同源性超过99.5%;聚类分析结果也显示它们共同聚类到CCYV分支中,这些结果说明山东黄瓜上分离的病毒为瓜类褪绿黄化病毒,这也是山东省黄瓜作物上瓜类褪绿黄化病毒基因组序列的首次报道。很多研究结果显示病毒编码蛋白的亚细胞定位是其行使功能的基础和场所,因此研究病毒编码蛋白的亚细胞定位有益于推进病毒编码蛋白功能的解析。而目前在CCYV上编码蛋白的亚细胞定位研究报道还较少,为明确其编码蛋白的亚细胞分布,我们对其编码的9个蛋白进行克隆并构建带有YFP荧光标签的表达载体,浸润本氏烟叶片后利用激光共聚焦显微镜进行观察,结果发现在9个蛋白中P6-1、P4.9、P9、CP、CPm在细胞能正常转录表达（Western blot）,这些蛋白在细胞质和细胞核均有分布,其中CPm在核仁有富集;而剩余的P22、P26（表达微弱）、P6-2、HSP70h等几个基因表达不好（Western blot未检测到）,未对其定位进行研究。而目前在CCYV编码蛋白中,仅有P4.9有定位研究报道（与本研究一致）。这些工作为后续研究其在病毒侵染致病过程中的作用奠定了基础。CCYV虽然编码蛋白较多,但有功能报道的蛋白较少,为研究其编码蛋白在病毒致病过程中的作用,本研究对CCYV编码的10个基因(RNA1编码P6-1和P22,RNA2编码（CP、CPm、HSP70h、P59、P26、P9、P6-2、P4.9）进行克隆,并利用马铃薯X病毒（PVX）异源病毒载体对其致病特征进行了研究,结果发现有8个基因在浸润接种的本氏烟上会引起更严重的症状:P6-1诱导新叶出现明显黄化、皱缩和坏死;P22诱导出现系统性坏死;P4.9诱导上部叶片皱缩、有坏死斑点;P6-2诱导上部叶片出现皱缩、伴有坏死斑点;P59诱导新叶变小、皱缩并伴有坏死斑点;CP诱导系统叶出现皱缩并伴有坏死斑点;CPm诱导上部叶片严重褪绿黄化;P26诱导植株上部叶片褪绿、花叶;而接种PVX的对照组植株仅表现轻微的花叶症状,暗示了这些基因可能参与了病毒侵染及致病等相关进程。而另外两个基因（HSP70h、P9）在本氏烟上引起的症状与对照组相近,推测其可能不直接作为致病因子参与症状形成。为进一步解析CCYV编码的致病相关候选因子的作用方式,本研究利用酵母双杂交系统对前期筛选获得的8个候选因子与病毒编码其它蛋白的互作关系进行了研究,结果发现在筛选的110个组合中,P22、P59、P6-2之间存在互作,而三者在异源过量表达时都会引起坏死,三者互作可能有利于相互调控,抑制其在病毒侵染时产生的坏死反应;同时P6-2及P59与HSP70h之间也发现存在互作,暗示了HSP70h可能参与抑制其产生的坏死反应;P59自身存在互作,暗示了其可能存在多聚蛋白参与病毒与寄主的互作。综上所述:本研究从山东黄瓜上分离了CCYV,并以此作为研究对象,对其全基因组进行了克隆和序列测定,明确了其基因组结构特征,同时利用共聚焦观察研究了编码蛋白的亚细胞定位特征,借助异源病毒表达系统研究了其编码蛋白的致病特征,明确了8个编码蛋白会加重病害症状,是致病相关候选因子,并利用酵母双杂交技术筛选了与其互作的病毒编码蛋白,初步探讨了其在病毒侵染致病过程中可能的作用方式,为后续深入解析CCYV编码蛋白在致病过程中的作用机理奠定了基础,同时也为后续有针对性的制定靶向病毒致病关键进程的病毒防控策略提供了借鉴。
施研进[2]（2014）在《石河子及北屯地区猪TTV及PCV2的基因检测及基因型分析》文中提出猪源输血传播病毒（Torque Teno virus，TTV）在世界大部分猪场都有较高的感染率。人源TTV感染人后，会发生重型肝炎等症状；圆环病毒2型（Circovirus type2，PCV2）是影响和诱发猪死亡和发病的重要病原之一。为了解石河子及北屯地区猪源TTV及PCV2的感染情况，并进一步研究猪源TTV与圆环病毒2型间是否存在协同影响的作用，本研究对在石河子地区及北屯地区猪源样品进行了TTV和PCV2的基因检测，并对流行毒株的基因型进行了分析。研究中采用康为世纪公司的血液基因组小量提取试剂盒，对石河子屠宰场随机采集的206份猪抗凝血液、北屯地区屠宰场采集的72猪抗凝血液，及石河子周边猪场采集的不同日龄仔猪抗凝血液50份、母猪的抗凝血液10份进行DNA提取。根据相关数据合成了三对引物，建立了用于检测TTV1、TTV2及PCV2的聚合酶链反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）检测方法，在此基础上，对反应条件进行了优化，建立了检测TTV1和PCV2的双重PCR检测方法。利用本研究建立的PCR检测方法，对采集样品进行检查，同时选取部分阳性样品，对PCR产物采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，对纯化的PCR产物进行TA克隆，经PCR鉴定后进行序列测定。主要结果如下：1、石河子和北屯地区猪TTV1感染率为41.4%（140/338）；TTV2的感染率为21.3%（72/338）；TTV1和TTV2混合感染率为8.9%（30/338）；PCV2的感染率为4.3%（12/278）。2、在石河子地区检测的8例PCV2阳性样品中有5例为TTV1与PCV2混合感染，有1例为TTV2与PCV2混合感染，有1例为TTV1、TTV2与PCV2混合感染，一例为PCV2阳性。在石河子周边养猪场采集5份外观为PCV2发病猪，进行解剖，并进行PCR检测，发现5份病猪全部为PCV2及TTV混合感染。3、选取部分阳性样品进行序列测定，将分离株的基因序列与Genbank登录的已知猪TTV1、TTV2、PCV2序列进行比对。结果显示本研究获得的TTV1序列与已报道序列的同源性为82.34%-95.59%；TTV2序列与已报道序列的同源性为83.75%-96.17%；所获PCV2序列与PCV2a参照序列之间的同源性为86.4%-87.4%，与PCV2b参照序列之间的同源性为92.9%-96.4%，表明所获PCV2序列为2b型。4、建立了检测TTV1和PCV2的双重PCR方法。采用双重PCR方法检测检测临床样品与相应的TTV1PCR检测结果和PCV2PCR检测结果无明显差异。
张洪兵[3]（2014）在《昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究》文中进行了进一步梳理输血传播病毒（Torque teno virus, TTV）是一种无囊膜的单股负链DNA病毒,关于其病毒分类尚有争议,目前该病毒归于圆环病毒科（Circoviridae）指环病毒属（Anellovirus）。该病毒发现于1997年,一位日本学者采用差异显示分析法（representational difference analysis, RDA）在一例心脏手术输血后发生急性感染的非甲-庚型肝炎病人进行血清分析时发现的,被称为输血传播病毒。研究发现TTV可感染人和多种动物,且在人群中的感染率很高。输血传播病毒呈世界性分布,它的基因组有高度的变异性,在人与动物中的流行状况也不尽相同,而目前国内的研究尚缺乏对更多不同地区的人类输血传播病毒流行病学的研究数据,这就包括病毒的基因型别和感染率。此外,无论是体内实验还是体外实验,输血传播病毒的研究进展都较为缓慢,尤其是病毒在健康人群的流行病学。因此,为了了解该病毒的分子流行病学特点,和全基因组特征,以及为输血传播病毒所可能带来的疾病提供科学的防控依据,本实验对昆明市体检人群血清样品开展了输血传播病毒感染的分子流行病学研究。本研究中,提取昆明市体检人群血清中的病毒基因组,根据GenBank上发表的TTV标准株序列（AB008394）,并参考相关文献,设计合成针对TTV核苷酸序列较为保守的非编码区（Untranslated Region, UTR）的引物,建立了用于检测人TTV的巢式PCR方法。对昆明市某高校体检人群的224份血液样品进行了检测,检测到了151份,结果表明体检人群中TTV的感染率达到了67.41%。依据国外已经发表的研究,针对输血传播病毒核苷酸序列变异率比较大的开放阅读框1（Open Reading Frame one, ORF1）设计并合成了N22区引物,同时合成了输血传播病毒第四基因群（Group4,G4）和第五基因群（Group5,G5）的分型引物,对上一步扩增较好的样品120份进行分型实验。以PCR方法对鉴定引物筛选为阳性的血清样品进行基因分型。对其中PCR扩增效果较好的样品进行序列测定与分析,建立系统进化树。分型结果表明,N22区引物扩增出了21份,占实验样品的17.5%,以G4引物扩增了50份样品,检测出了13份阳性,比例为26%,G5引物扩增了50份,检出24份,阳性率为48%。大部分毒株与TTV Gla型相符合,而进化关系稍远的有可能是基因变异造成成的。设计并合成了五对引物,对TTV全基因组进行克隆与序列测定,并进行了序列拼接,建立了此株病毒的系统进化树,分析了氨基酸的同源性。系统进化分析表明此毒株属于TTV1a型。核苷酸同源性与氨基酸同源性分析表明与TTV1a型的相似度最高。以上研究结果表明,输血传播病毒在昆明市体检人群中的检出率为67.41%,由此推断此病毒在昆明还是有着较高的流行率：基因分型和系统进化分析表明,昆明的优势流行株还是TTV的G1a型。本实验对昆明市体检人群输血传播病毒的分子流行病学作了较为系统的调查研究,以上研究结果为输血传播病毒在体检人群中的流行状况和基因型别提供了参考依据,为输血传播病毒的进一步研究打下了坚实基础。
李俊[4]（2012）在《猪圆环病毒2型遗传演化及含CpG基序的核酸疫苗研制》文中研究指明猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）分为无致病性的PCV1和有致病性的PCV2两个基因型。PCV2能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道病复合征（PRDC）、猪的流产和死亡综合征（SAMS）、猪增生性和坏死性肺炎（PNP）和猪先天性脑震颤（CT）等，并能导致母猪繁殖障碍和引起免疫抑制，给养猪业造成严重的经济损失。该病已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征之后新发现的重要猪传染病。近年来该病毒不断发生变异，新的毒株不断出现，给该病的防控带来了一定的压力。为了深入了解本病的流行情况及研制新型的基因工程疫苗用于该病的防治，本研究在流行病学调查的基础上，分离鉴定了3株PCV2，对17株病毒进行了全基因组克隆测序并进行了PCV2遗传演化分析；调查了PCV2同属的Torque teno virus （TTV）在山东省猪群中的流行情况；建立了荧光定量PCR检测方法和PCV2小鼠动物模型；研制了含CpG基序的PCV2核酸疫苗。主要表现为：对山东省规模化猪场进行了猪圆环病毒感染率的流行病学调查，发现猪圆环病毒的感染率呈逐年上升趋势，2005-2011抗原阳性率由11.3%增加到40.38%，抗体阳性率由38.7%增加到72.99%。混合感染现象仍很严重，二重感染中PCV+CSFV所占比例最大，为33.81%；三重感染中PCV+PRRSV+CSFV所占比例最大，为4.32%。在此基础上完成3株PCV2的分离鉴定工作，并进行了系列生物学鉴定。其中SD株（JQ653449）传代至第20代病毒毒价为106.0TCID50/mL。目前该病毒传至75代，效价稳定可以作为灭活疫苗的候选毒株。完成17株猪圆环病毒的全基因克隆测序。通过与从已公布的国内外PCV2分离株的比较分析发现国内PCV2一直在不断的变异，PCV2b是目前国内流行株，出现PCV2a和PCV2b重组型病毒，其基因组特征为ORF1来自PCV2a，ORF2来自PCV2b。PCV2基因型与地域无明显相关性。国内流行的圆环病毒的遗传演化规律为PCV2a型到PCV2a和PCV2b重组型病毒再到PCV2b型，未发现PCV2c型。对PCV2小鼠动物感染模型的构建进行了初步研究。根据攻毒组小鼠脾脏、淋巴结内持续的病毒复制、血清PCV2抗体生成、明显的病理损伤得出PCV2感染昆明小鼠的结论，本试验初步建立了PCV2感染昆明小鼠的动物感染模型，并发现证明了PCV2可在昆明小鼠中水平传播。这为PCV2的致病机理研究及疫苗免疫效果评价等奠定了理论基础。建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测PCV2的方法。建立的检测方法特异性强、重复性好；敏感性达10个拷贝；在应用于临床检测时，可将反应时间缩短为1.5小时。为PCV2的临床检测提供了新的方法，并制定了山东省地方标准：猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术（DB37/T 1827-2011），在全省范围内推广应用。克隆了PCV2核衣壳蛋白基因ORF2，并插入到真核表达载体pVAX1中，成功构建pVAX1-ORF2。在前期动物实验的基础上人工合成了2条对猪具有免疫增强作用的CpG基序并成功插入到pVAX1-ORF2真核表达载体，获得2种含CpG基序的CpG-pVAX1-PCV2 ORF2核酸疫苗。对2种核酸疫苗在猪体进行了动物实验，利用试剂盒检测了其抗体效价和IL-2产生水平，并用流式细胞术对其细胞免疫效果进行了测定，对其免疫原性进行了探讨。申报了猪圆环病毒核酸疫苗的转基因安全评价中试，并获批（农基安办字2010-T179）。通过对2种含CpG基序的核酸疫苗猪体试验，确定了最佳的CpG-pVAX1-ORF2及免疫剂量，筛选出的最佳核酸疫苗能够增加猪的平均日增重，并能刺激机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，可有效阻止病毒在体内的增殖。本研究的主要创新点：1、病原流行病学调查结果表明，2005年至2011年，山东省PCV2的感染率呈逐年上升趋势。发现PCV2b是目前国内流行株，出现PCV2a和PCV2b重组型病毒。2)建立了PCV2的荧光定量PCR诊断方法，并制定了山东省地方标准（DB37/T1827-2011），为诊断PCV2感染提供了技术手段。3)建立了PCV2感染昆明小鼠的动物感染模型，发现并证明了PCV2可在昆明小鼠中水平传播。4)在国内外率先研制含CpG基序的CpG-pVAX1-PCV2 ORF2（核酸疫苗），有效提高了核酸疫苗的免疫效果，取得农业部转基因产品中试批文（农基安办字2010-T179）。
赵玲[5]（2011）在《猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析》文中认为根据基因型的不同,参照GeneBank上发表的TTV1（GU570198.1）和TTV2（AY823991.1）的序列,各设计两对巢式引物用于检测TTV1和TTV2。采集生猪血液样品若干份,提取病毒DNA,用巢式PCR技术,扩增出TTV1、TTV2非编码区特异性目的基因片段,将目的片段回收进行克隆测序,以确定为感染TTV1与TTV2病毒。再用阳性TTV DNA为模板,对巢式PCR反应条件进行优化,通过重复性、敏感性、特异性试验来验证该方法的准确性。最后,将优化好的TTV1、TTV2检测方法用于对所采集的127份血清样品进行PCR检测。结果可看出,本研究建立的巢式PCR检测方法重复性、敏感性、特异性较好,适用于临床大规模的检测。针对四川省采集鉴定为TTV1和TTV2阳性的血清样品各两份,参照GeneBank上发表的猪输血性传播病毒1型（TTV1）和2型（TTV2）全基因组核苷酸序列（AB076001.1、GU456386.1）,设计特异性引物,采用巢式PCR的方法扩增TTV1和TTV2全基因组序列,分别进行克隆、测序和拼接,并对其进行遗传进化分析和同源性分析。结果表明,两株TTV1基因组全长分别为2852bp和2917bp；两株TTV2基因组全长分别为为2802bp和2798bp,TTV1-SC1、TTV1-SC2与已公布的TTV1基因组序列相似性分别为81%～95%、82%～94%。TTV2-SC1、TTV2-SC2与已公布的TTV2基因组序列相似性分别为88%-99%、80%-96%。系统进化树分析表明,分离株TTV1-SC1与TTV1 Bj10株（HM633251.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC2与TTV2SH0822／2008株（GU450331.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC1、TTV2-SC2与PTTV2c-VA株（GU456386.1）亲缘关系最近。通过对TTV.ORF1蛋白抗原性分析,疏水性分析和二级结构分析,推测TTV1-SC1-ORF1的抗原表位集中在155aa。173aa、409aa-423aa和470aa-497aa这三个区域之间。TTV1-SC2-ORF1的抗原表位集中在46aa-62aa、169aa-175aa和321aa-337aa这三个区域之间。而TTV2两个毒株的一级结构同源性较高,氨基酸的差异并没有影响到蛋白质的抗原性,推测TTV2.SC1-ORF1和TTV2-SC2-ORF1的抗原表位都集中在268aa-279aa、379aa-390aa、505aa-511aa和517aa-533aa这四个区域之间,这些分析结果是否能说明此区域就是真正的抗原表位,还需实验证实。本研究有利于监测猪TTV1与TTV2的疫源和进化情况,为进一步深入研究病毒形态结构、遗传与变异和基因功能特点奠定一定的生物学基础。
刘建波,郭龙军,危艳武,黄立平,吴洪丽,刘长明[6]（2011）在《猪输血传播病毒（TTV）与猪圆环病毒混合感染的检测及TTV遗传变异分析》文中研究说明为了解我国猪群中猪输血传播病毒（TTV）与猪圆环病毒（PCV）混合感染情况,本研究采用PCR方法对采自14个省280份病料样品进行检测,结果显示,TTV1和TTV2阳性检出率分别为51.8%和28.2%,TTV1与TTV2混合感染率为18.2%;PCV1和PCV2阳性率分别为41.1%和37.5%,PCV1与PCV2混合感染率为19.6%;PCV2阳性样品中TTV1和TTV2混合感染率达75.0%。此外,对2株TTV1基因组进行测序,与GenBank中登录的6个TTV1序列比对,相似性结果为67.3%～95.1%;对4株TTV2基因组测序,与GenBank登录的4条TTV2序列比对,相似性为84.7%～90.4%;将TTV1与TTV2进行序列比对,相似性仅为44.0%。TTV1和TTV2基因高变区分别位于520 nt～2 594 nt和720 nt～2 170 nt;TTV1基因保守区位于1 nt～520 nt和2 595 nt～2 800 nt;而TTV2基因保守区位于1 nt～719 nt和2 171 nt～2 800 nt。以上结果表明,我国猪群中存在TTV与PCV2的混合感染,并且两种病毒混合感染引起的相关疾病可能存在协同致病性;TTV1和TTV2基因型差异较大,具有遗传变异多样性的特点。
于建国[7]（2007）在《新型肝炎病毒研究策略与对策》文中研究说明病毒性肝炎是一个古老的传染病。病毒性肝炎的病原学历来是人们研究的一个热点。自从1965 年发现乙肝病毒表面抗原（HBsAg）,1975年发现甲肝病毒（HAV）和1977年发现丁肝病毒（HDV）以来,仍有部分肝炎病因得不到明确诊断,查不到病原
陈庆新[8]（2006）在《圆环病毒2型感染的流行病学分析及其突变体致病性》文中研究说明猪圆环病毒2型（Porcine circovims type 2，PCV2）属于圆环病毒科，基因组全长为1768nt或1767nt，除ORF1和ORF2两大阅读框外，还潜在9个ORFs。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2编码PCV2免疫相关的蛋白Cap。PCV2是引起PMWS的主要病原，主要表现为免疫系统的损伤，使感染猪处于严重免疫抑制状态。本课题主要进行了PCV2的血清流行病学，分子流行病学和基因组各阅读框的致病性等方面的研究。应用无PCV污染的PK-15细胞分离病毒，从浙江省境内11个地市分离获得10株PCV2病毒。分离的病毒株经超速密度梯度离心纯化后，电镜下可观察到直径17-20nm的病毒粒子；分离病毒株的核苷酸测序结果显示，所用分离株的基因组长度均为1767bp。应用IFA技术，对浙江省内11个不同地区104个规模化猪场2000-2004年期间的4，307个血清样本进行PCV2的血清学流行病学调查，通过对不同地区、年份、年龄和品种猪的血清学数据分析，结果显示，所检测浙江省猪场均存在PCV2感染，猪群PCV2感染率为68.10％，种猪感染的血清阳性率为66.88％，断奶后猪感染的血清阳性率为82.10％。长白种猪感染的血清阳性率为44.83％、长白仔猪PCV2感染的血清阳性率为64.28％，明显高于大约克和杜洛克的种猪和仔猪。PCV2感染的血清阳性率高的种猪和仔猪群，其PRRSV和PRV的抗体阳性率低。通过对未免疫PRRSV疫苗的猪场进行血清学调查发现，PCV2感染率高的猪群，其PRRSV的感染率也随之升高。这些结果说明PCV2在猪群中的感染非常普遍，不同品种猪对PCV2的易感性不同，PCV2的感染降低了猪群对疫苗的免疫应答，PCV2的感染增加了PRRSV感染水平。以IFA和IPMA技术，对2004-2005年2，352份人血清与2005年奶牛、鸡、鸭、和山羊血清进行PCV2相关抗体的血清学检测，在689份人血清中检测到PCV2相关抗体，PCV2相关抗体阳性率为29.3％，没有在奶牛、鸡、鸭、和山羊中检测到PCV2相关抗体的存在。数据分析表明：2005年人群中PCV2的阳性率显着高于2004年（p＜0.01）；不同地区PCV2相关抗体阳性率差异不显着性（p＞0.05）；40至49年龄段人群抗体阳性率最高（OR=1.390[95％CI，1.011-1.9101，p=0.042），女性的阳性率高于男性；PCV2相关抗体阳性率与HBV感染和ALT水平的升高不存在相关性。根据PCV2-HZ0201株序列设计引物，扩增HZ0201的全基因组和各ORF突变全基因组，构建PCV2-HZ0201正常、ORF3和ORF4双突变（PCV2-MF3／4）、ORF5至11单ORF突变（PCV2-MF5至11）等基因组的重组质粒；将实验室保存的PCV2-MF3和PCV2-MF4与本研究中构建重组质粒中的PCV2全基因酶切，环化后转染PK-15细胞，转染细胞进行连续6次传代。PCV2正常的感染性克隆、PCV2-MF3、MF4、MF5、MF9、MF10和MF11在转染后和传代后均能够用PCR和IFA检测到PCV2病毒的存在，测序分析显示突变位点仍然存在；TCID50测定结果显示与野毒株相比未见明显差异，而ORF3-ORF4、ORF6、ORF7和ORF8缺失后则不能检测到病毒抗原和核酸存在。这些结果表明，ORF3-ORF4、ORF6、ORF7和ORF8或其突变点可能与病毒的复制有关；而ORF5、ORF9、ORF10、和ORF11或其突变点与病毒的复制无关。将PCV2-HZ0201、正常感染性克隆（IC）及突变体（PCV2-MF3至5、PCV2-MF9-11），腹腔和鼻内接种8周龄BALB／c小鼠，研究突变后的PCV2对小鼠致病性变化。PCV2-HZ0201、IC、PCV2-MF3和PCV2-MF4组，在7-14天出现抗体，28天左右抗体水平最高，随后开始下降；PCV2-MF5、PCV2-MF9至11接种后14-21天出现抗体，35天左右抗体水平最高，随后开始下降。PCV2-HZ0201，IC，PCV2-MF4、PCV2-MF9和PCV2-MF10通过Caspase-3和Caspase-8途径诱导细胞凋亡，感染后21天脾脏凋亡细胞数显着上升，CD3+CD4+、CD4+CD8+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量显着下降，病理切片可观察到淋巴细胞缺失和凋亡现象，并出现病毒血症；感染后42天有所恢复。PCV2-MF3和PCV2-MF5接种小鼠后未诱导脾脏内凋亡细胞水平升高，和CD3+CD4+、CD4+CD8+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量显着降低，大部分小鼠切片未观察到明显病理变化和病毒血症。PCV2-MF11感染小鼠后21天未显着诱导脾脏细胞凋亡和降低CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量；但感染后42天显着降低CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量，并出现病毒血症和脾脏淋巴细胞缺失现象。以上结果表明，ORF3，ORF5和ORF11突变后部分的改变了PCV2的致病性，可能存在于PCV2基因组中，是构成致病力的一部分；而ORF9和ORF10突变后没有引起PCV2致病性发生明显变化，与PCV2的致病性无关，其存在的可能性很小。ORF4突变后造成了PCV2一定程度的降低，但不十分显着，或许其致病性的激活需要其他因素，如免疫刺激等，其存在性仍值得进一步探究。
于建国,商庆华,孙思才,任诰,肖德明,尹燕明[9]（2003）在《山东泰安地区TTV检测和部分基因克隆及序列测定》文中研究指明目的 探讨山东非甲 -庚肝炎和肝癌患者输血传播病毒 （TTV）感染状况和基因变异情况。方法 应用逆转录聚合酶链反应 （PCR）检测 2 6例山东泰安地区非甲 -庚型肝炎和 12例肝细胞癌 （HCC）患者血清中TTV DNA ,并对阳性扩增的产物利用 PCR技术片段直接克隆和测序 ,分析其基因变异的情况。结果 2 6例非甲 -庚型肝炎中 11例 TTVDNA阳性 （42 .3%）。对其中两株 （TTVSD4、TTVSD5 ）部分基因克隆测序 ,并与日本株（ABOO8394）相比较 ,其核苷酸序列同源性分别为 99.9%和 10 0 %。而 12例肝细胞癌患者中 3例 TTVDNA阳性（2 5 .0 %） ,对其中一株 （TTVSD6 ）部分基因克隆与测序 ,与日本株 （ABOO8394）相比较 ,其核苷酸序列同源性为99%;TTV山东泰安三株间核苷酸同源性均为 99%。结论 研究证实山东泰安地区非甲～庚型肝炎和肝细胞癌患者中存在着较高 TTV感染 ,TTV感染可能具有嗜肝性 ,而且可能与肝功能损害有关 ,是引起非甲～庚型肝炎的重要病原。
于建国,商庆华,任诰,肖德明,尹燕明,白薇,戚中田,张光曙[10]（2003）在《山东地区输血传播病毒（TTV）检测及部分基因克隆和序列测定》文中研究表明目的 了解TTV山东分离株感染状况及基因变异的情况。方法应用逆转录聚合酶链反应（PCR）检测26例山东地区非甲-庚型肝炎和12例肝细胞癌患者血清中TTV DNA,并对阳性扩增的产物利用PCR技术直接克隆和测序,分析其基因变异的情况。结果26例非甲-庚型肝炎中11例TTV DNA阳性（42％）。对其中两株（TTVSD4、TTVSD5）部分基因克隆测序,并与日本株（ABOO8394）相比较,其核苷酸旬同源性为99.9％和100％。而12例肝细胞癌患者中3例TTV DNA阳性（25％）,对其中一株（TTVSD6）部分基因克隆与测序,与日本株（ABOO8394）相比较,其核苷酸序列同源性为99％;TTV山东株三株间核苷核同源性均为99％。结论本研究证实山东地区非甲-庚型肝炎和肝细胞癌患者中存在着较高TTV感染,TTV感染可能具有嗜肝性,而且可能与肝功能损害有关,是引起非甲-庚型肝炎的重要病原。
二、山东地区TTV检测和部分基因克隆及序列测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、山东地区TTV检测和部分基因克隆及序列测定（论文提纲范文）
（1）CCYV山东黄瓜分离物基因组结构特征及致病相关蛋白研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 黄瓜病毒病的种类及危害特点 |
| 1.3 瓜类褪绿黄化病毒研究进展 |
| 1.3.1 瓜类褪绿黄化病毒的分布 |
| 1.3.2 瓜类褪绿黄化病毒的寄主范围和传播方式 |
| 1.3.3 瓜类褪绿黄化病毒基因组结构特征 |
| 1.3.4 瓜类褪绿黄化病毒检测与防治 |
| 1.3.5 瓜类褪绿黄化病毒编码蛋白的研究进展 |
| 1.4 毛形病毒属编码蛋白功能的研究进展 |
| 1.5 本研究中用到的关键技术体系 |
| 1.5.1 亚细胞定位技术的应用 |
| 1.5.2 酵母双杂交技术的应用 |
| 1.6 研究内容及意义 |
| 第2章 山东寿光黄瓜上瓜类褪绿黄化病毒的分子鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试病毒病样 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 黄瓜样品总RNA提取 |
| 2.1.4 反转录 |
| 2.1.5 CCYV病毒检测 |
| 2.1.6 CCYV CP基因克隆 |
| 2.1.7 目的片段回收 |
| 2.1.8 目的片段连接PMD18-T |
| 2.1.9 转化大肠杆菌 |
| 2.1.10 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 2.1.11 质粒提取 |
| 2.1.12 酶切验证 |
| 2.1.13 CCYV CP序列分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 病害田间症状 |
| 2.2.2 瓜类褪绿黄化病毒的检测 |
| 2.2.3 CCYV的 CP蛋白基因克隆 |
| 2.2.4 CCYV CP序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 瓜类褪绿黄化病毒山东黄瓜分离物基因组序列克隆及特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 RNA提取 |
| 3.1.3 反转录 |
| 3.1.4 CCYV基因组克隆 |
| 3.1.5 序列测定及分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CCYV基因组克隆策略 |
| 3.2.2 CCYV基因组分段克隆 |
| 3.2.3 CCYV山东黄瓜分离物基因组特征 |
| 3.2.4 CCYV山东黄瓜分离物聚类分析 |
| 3.2.5 CCYV山东黄瓜分离物与已报道黄瓜分离物突变位点分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 瓜类褪绿黄化病毒编码蛋白的亚细胞定位特征分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试CCYV毒源 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.1.3 病样总RNA的提取及c DNA合成 |
| 4.1.4 基因克隆 |
| 4.1.5 荧光表达载体的构建 |
| 4.1.6 亚细胞定位观察 |
| 4.1.7 转录产物的RT-PCR检测 |
| 4.1.8 转录产物的Western blot分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CCYV编码基因克隆 |
| 4.2.2 荧光表达载体的构建 |
| 4.2.3 编码蛋白的亚细胞定位特征分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 瓜类褪绿黄化病毒致病相关蛋白的筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试CCYV毒源 |
| 5.1.2 试验材料 |
| 5.1.3 病样总RNA的提取及c DNA合成 |
| 5.1.4 基因克隆 |
| 5.1.5 异源表达载体的构建 |
| 5.1.6 重组蛋白的致病性分析 |
| 5.1.7 重组蛋白的RT-PCR检测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 CCYV基因克隆 |
| 5.2.2 异源病毒表达载体构建 |
| 5.2.3 蛋白致病特征分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 瓜类褪绿黄化病毒编码的致病相关蛋白作用方式初步研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 供试CCYV毒源 |
| 6.1.2 试验材料 |
| 6.1.3 病样总RNA的提取及c DNA合成 |
| 6.1.4 CCYV编码基因克隆 |
| 6.1.5 CCYV基因酵母双杂交载体的构建 |
| 6.1.6 CCYV致病候选因子与其他蛋白之间的互作及自激活验证 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 病毒基因的克隆 |
| 6.2.2 酵母双杂交载体构建 |
| 6.2.3 CCYV编码蛋白酵母双杂交载体自激活验证 |
| 6.2.4 酵母双杂交验证CCYV编码致病候选因子与其他蛋白之间互作 |
| 6.3 讨论 |
| 第7章 结论与创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 常用缓冲液及试剂配制方法 |
| 个人简介 |
（2）石河子及北屯地区猪TTV及PCV2的基因检测及基因型分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英语字母缩写和中英文全称对照表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 TTV 研究进展 |
| 1.1 TTV 的分类及病原特点 |
| 1.1.2 TTV 的病原特点 |
| 1.2 TTV 的检测方法 |
| 1.2.1 TTV 的 PCR 检测 |
| 1.2.2 TTV 的基因分型 |
| 1.2.3 TTV 的原位杂交检测法 |
| 1.3 TTV 致病性 |
| 1.4 TTV 传播途径 |
| 1.5 TTV 流行情况研究 |
| 1.6 TTV 病毒的治疗 |
| 2 猪圆环病毒 2 型 |
| 2.1 猪圆环病毒 2 型分类及病原特点 |
| 2.1.1 猪圆环病毒 2 型分类 |
| 2.1.2 猪圆环病毒 2 型病原特点 |
| 2.2 PCV2 检测技术 |
| 2.2.1 PCV2 的 PCR 检测 |
| 2.2.2 PCV2 的原位杂交技术 |
| 2.2.3 PCV2 的 ELISA 检测 |
| 2.3 PCV2 的致病性 |
| 2.4 猪圆环病毒病的临床表现 |
| 2.5 PCV2 传播途径 |
| 2.6 PCV2 流行情况 |
| 2.7 PCV2 防治方法 |
| 3 TTV 与 PCV2 混合感染研究 |
| 第一章 石河子及北屯地区 TTV 的 PCR 检测及不同日龄 TTV 的感染情况对比 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 血液样品 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总 DNA 提取 |
| 1.2.3 PCR 扩增 |
| 1.2.4 PCR 产物鉴定 |
| 1.2.5 回收纯化 DNA 片段 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 感受态细胞制备 |
| 1.2.8 连接产物的转化 |
| 1.2.9 序列测定分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 检测结果 |
| 2.2 阳性克隆 PCR 检测结果 |
| 2.3 序列分析结果 |
| 2.4 不同日龄仔猪及母猪感染率调查 |
| 3 分析与讨论 |
| 第二章 石河子及北屯地区 PCV2 型 PCR 检测及基因型分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品采集 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总 DNA 提取 |
| 1.2.3 PCR 扩增 |
| 1.2.4 PCR 产物鉴定 |
| 1.2.5 回收纯化 DNA 片段 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 连接产物的转化 |
| 1.2.9 序列测定 |
| 1.2.10 临床剖检 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 检测结果 |
| 2.2 测序结果 |
| 2.3 同源性分析结果 |
| 2.4 进化树分析结果 |
| 2.5 临床剖检猪场中发现的突然死亡的仔猪 |
| 3 讨论与结论 |
| 第三章 TTV1 与 PCV2 双重 PCR 检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 血液样品 |
| 1.1.2 实验室使用器材 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 主要方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 总 DNA 提取 |
| 1.2.3 PCR 扩增 |
| 1.2.4 双重 PCR 检测方法的建立 |
| 1.2.5 PCR 产物鉴定 |
| 1.2.6 回收纯化 DNA 片段 |
| 1.2.7 感受态细胞制备 |
| 1.2.8 连接反应 |
| 1.2.9 连接产物的转化 |
| 1.2.10 序列测定 |
| 1.2.11 敏感性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 检测结果 |
| 2.1.2 双重 PCR 反应条件的优化结果 |
| 2.1.3 双重 PCR 的灵敏度试验 |
| 2.1.4 双重 PCR 的重复性试验 |
| 2.1.5 临床应用 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图和附表清单 |
| 英文缩略词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 输血传播病毒概述 |
| 1.1.1 TTV病毒理化及生物学特性 |
| 1.1.2 TTV所属科属 |
| 1.2 输血传播病毒基因组及其重要蛋白研究进展 |
| 1.2.1 TTV基因组特点 |
| 1.2.2 TTV的蛋白质 |
| 1.2.3 TTV基因群 |
| 1.3 输血传播病毒可能的致病性 |
| 1.3.1 肝损伤 |
| 1.3.2 肺部疾病 |
| 1.3.3 血液学疾病 |
| 1.3.4 特发性炎症性肌病 |
| 1.3.5 免疫学状况 |
| 1.3.6 系统性红斑狼疮 |
| 1.4 输血传播病毒在人体组织的分布 |
| 1.5 输血传播病毒传播途径 |
| 1.5.1 血液传播 |
| 1.5.2 粪-口途径传播 |
| 1.5.3 母婴垂直传播 |
| 1.5.4 飞沫传播 |
| 1.5.5 性传播 |
| 1.6 输血传播病毒流行状况 |
| 1.7 输血传播病毒检测方法 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 昆明体检人群TTV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 血清样品PCR检测 |
| 2.2.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒序列测定与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 检测体系的评价 |
| 2.3.2 对检测结果的分析 |
| 2.3.3 由输血传播病毒感染所引发的思考 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 输血传播病毒变异分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 分型引物PCR检测 |
| 3.2.2 序列测定及分析 |
| 3.2.3 同源性及遗传进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 分型引物的设计 |
| 3.3.2 TTV基因型的特点 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 输血传播病毒全基因组序列分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 TTV全基因组分段扩增结果 |
| 4.2.2 各片段重组质粒双酶切鉴定 |
| 4.2.3 序列拼接 |
| 4.2.4 系统进化树分析 |
| 4.2.5 同源性分析 |
| 4.2.6 重组事件分析 |
| 4.2.7 TTV结构蛋白疏水性及抗原表位分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（4）猪圆环病毒2型遗传演化及含CpG基序的核酸疫苗研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写符号及中英对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一、猪圆环病毒的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 分类地位及生物学特性 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 PCV 理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 病毒基因组结构 |
| 1.3 病毒基因组编码的主要蛋白 |
| 1.3.1 Rep 蛋白 |
| 1.3.2 Cap 蛋白 |
| 1.3.3 ORF3 基因编码的非结构蛋白 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 流行情况及分布 |
| 2.2 易感动物 |
| 2.3 传播途径 |
| 3 PCV2 诊断技术 |
| 3.1 病原学方法 |
| 3.1.1 病毒的分离与鉴定 |
| 3.1.2 原位核酸杂交 |
| 3.1.3 免疫组织化学试验 |
| 3.1.4 PCR 技术 |
| 3.1.4.1 常规 PCR |
| 3.1.4.2 多重 PCR 检测 |
| 3.1.4.3 实时荧光定量 PCR 检测 |
| 3.2 血清学方法 |
| 3.2.1 免疫过氧化物酶单层细胞试验 |
| 3.2.2 间接免疫荧光试验 |
| 3.2.3 酶联免疫吸附试验 |
| 4 疫苗研究进展 |
| 4.1 PCV2 灭活疫苗 |
| 4.2 PCV2 弱毒疫苗 |
| 4.3 PCV2 亚单位疫苗 |
| 4.4 PCV2 核酸疫苗 |
| 二、CpG 的研究进展 |
| 第二部分 实验论文 |
| 第一章： 流行病学调查 |
| 一：猪圆环病毒 2 型流行病学调查 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 二：猪圆环病毒 2 型毒株的分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 三：山东省猪群 TTV 的感染情况及其分子流行病学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 四：山东省猪圆环病毒 2 型分子特征及遗传演化分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 五：SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测猪圆环病毒 2 型方法的建立与初步应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第二章： 猪圆环病毒 2 型核酸疫苗研制及动物模型建立 |
| 六：猪圆环病毒 2 型感染昆明小鼠模型的建立：病毒分布和病理损伤的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 七：含 CpG 基序的猪圆环病毒 2 型核酸疫苗的构建 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 八：含 CpG 基序的猪圆环病毒 2 型核酸疫苗免疫效力评价 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 九：含 CpG 基序的猪圆环病毒 2 型核酸疫苗的中试实验 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 输血性传播病毒的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 TTV的理化性质 |
| 1.2 TTV DNA的结构和功能 |
| 1.3 TTV的分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 人的TTV感染 |
| 2.2 灵长类动物的TTV感染 |
| 2.3 猪的TTV感染 |
| 3 致病性 |
| 4 检测方法 |
| 4.1 TTV分子生物学的检测方法 |
| 4.2 TTV分型的检测 |
| 4.3 TTV的其他检测方法 |
| 4.3.1 血清免疫学法 |
| 4.3.2 原位杂交法 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与载体 |
| 1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCR引物的设计 |
| 2.2 病毒总DNA的抽提 |
| 2.3 PCR扩增 |
| 2.4 目的基因的克隆 |
| 2.4.1 PCR产物目的DNA片段的回收 |
| 2.4.2 连接 |
| 2.4.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.4.4 重组质粒的转化 |
| 2.5 阳性菌的鉴定 |
| 2.6 目的基因的序列测定 |
| 2.7 PCR扩增条件的优化 |
| 2.8 特异性实验 |
| 2.9 敏感性实验 |
| 2.10 重复性实验 |
| 2.11 TTV1、TTV2 PCR检测方法的临床应用 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 病料PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.2 特异性试验鉴定结果 |
| 3.3 敏感性试验鉴定结果 |
| 3.4 重复性试验鉴定结果 |
| 3.5 PCR的临床应用的鉴定结果 |
| 3.5.1 采用PCR进行检测 |
| 3.5.2 TTV1、TTV2的感染情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于引物设计 |
| 4.2 关于TTV1、TTV2病毒的确定 |
| 4.3 关于敏感性试验、特异性试验和重复性试验 |
| 4.4 关于PCR方法的临床应用 |
| 第三章 猪输血性传播病毒1型(TTV1)和2型(TTV2)全基因组的克隆与序列分析 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 病料 |
| 2 方法 |
| 2.1 TTV1与TTV2全基因组的克隆 |
| 2.1.1 病毒基因组DNA的提取 |
| 2.1.2 TTV1与TTV2全基因组的PCR扩增 |
| 2.1.3 PCR产物的克隆与序列测定 |
| 2.2 TTV1和TTV2全基因组的生物信息学分析 |
| 2.2.1 TTV1和TTV2基因组核苷酸序列同源性分析和进化树分析 |
| 2.2.2 TTV1和TTV2基因组核苷酸重复高变序列分析 |
| 2.3 TTV1和TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测 |
| 2.3.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性预测分析 |
| 2.3.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析 |
| 2.3.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白二级结构预测 |
| 2.3.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TTV1、TTV2全基因组的PCR扩增 |
| 3.2 PCR产物的克隆及测序 |
| 3.3 TTV1、TTV2全基因组序列的拼接 |
| 3.4 TTV1、TTV2全基因组的序列分析 |
| 3.4.1 TTV1、TTV2全基因组同源性分析与进化树 |
| 3.4.2 TTV1、TTV2基因组核苷酸高变缺失序列分析 |
| 3.5 TTV1、TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测 |
| 3.5.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性分析 |
| 3.5.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析 |
| 3.5.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白的二级结构预测 |
| 3.5.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于全基因组克隆 |
| 3.2 关于序列分析 |
| 3.3 关于ORF1蛋白分析 |
| 结论 |
| 1 TTV1和TTV2 PCR检测方法的建立 |
| 2 TTV1与TTV2全基因组克隆与序列分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录一 TTV1和TTV2全基因组测序结果 |
（6）猪输血传播病毒（TTV）与猪圆环病毒混合感染的检测及TTV遗传变异分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病料样品及细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 样品处理及DNA的提取 |
| 1.4 TTV1、TTV2、P CV1和P CV2的P CR检测 |
| 1.5 TTV1和TTV2全基因组扩增 |
| 1.6 基因组的克隆及质粒鉴定 |
| 1.7 基因组的序列测定及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病料样品的检测 |
| 2.2 TTV1和TTV2基因序列扩增 |
| 2.3 TTV1和TTV2基因组同源性分析 |
| 2.4 TTV1和TTV2系统进化树构建 |
| 2.5 TTV1和TTV2病毒株遗传变异分析 |
| 3 讨论 |
（8）圆环病毒2型感染的流行病学分析及其突变体致病性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 猪圆环病毒2型研究进展 |
| 1.病原学研究 |
| 1.1 PCV2的发现 |
| 1.2 PCV2的形态和理化特性 |
| 1.3 PCV2的分类地位 |
| 1.4 PCV2的分子生物学特征 |
| 2.流行病学研究 |
| 2.1 PCV2流行情况及分布 |
| 2.2 易感动物 |
| 2.3 传播方式及途径 |
| 3.PCV2致病机理研究 |
| 3.1 PCV2导致免疫系统病理的变化 |
| 3.2 PCV2导致外周血淋巴细胞的变化 |
| 4.PCV2检测技术 |
| 4.1 PCR技术 |
| 4.2 原位杂交 |
| 4.3 间接免疫荧光实验 |
| 4.4 免疫过氧化物酶单层细胞实验 |
| 4.5 酶联免疫吸附实验 |
| 5.与PCV2相关猪病 |
| 5.1 断奶后仔猪多系统衰竭综合症 |
| 5.2 猪肾病与皮炎综合症 |
| 5.3 猪呼吸疾病综合症 |
| 5.4 母猪繁殖障碍 |
| 5.5 肉芽肿性肠炎 |
| 5.6 仔猪先天性震颤 |
| 6.TTV相关病毒 |
| 6.1 TTV相关病毒的发现及分类 |
| 6.2 TTV的基因组结构特征 |
| 6.3 TTV的复制与转录 |
| 6.4 TTV的致病性 |
| 6.5 TTV的流行病学及检测 |
| 6.6 猪TTV |
| 6.7 PCV2与TTV的关系 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 PCV2分离和全基因组的克隆及序列分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 病料来源、细胞、载体与试剂 |
| 1.2 PCV2型病毒检测引物与全基因引物的设计 |
| 1.3 病料PCV2检测 |
| 1.4 PCV2病毒分离 |
| 1.5 PCV2分离株TCID_(50)测定 |
| 1.6 病毒蔗糖密度梯度离心纯化与形态观察 |
| 1.7 分离毒株全基因组扩增 |
| 1.8 分离毒株全基因组的克隆与序列分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 病料组织的PCR检测 |
| 2.2 病毒分离与毒力检测 |
| 2.3 病毒纯化与病毒形态 |
| 2.4 PCV2分离毒株全基因组的克隆与序列测定 |
| 2.5 PCV2分离毒株全基因组序列结构分析 |
| 2.6 不同年份浙江省分离毒株的突变位点分析 |
| 2.7 分离毒株的同源性与进化 |
| 2.8 ORF1核苷酸及推导氨基酸序列分析 |
| 2.9 ORF2核苷酸及推导氨基酸序列分析 |
| 2.10 ORF3核苷酸及推导氨基酸序列分析 |
| 3.讨论 |
| 第二章 PCV2在猪群中感染的血清流行病学调查 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 病毒、血清、细胞与试剂 |
| 1.2 猪血清样本收集 |
| 1.3 IFA试验 |
| 1.4 ELISA试验 |
| 1.5 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 猪场及猪群的PCV2阳性率 |
| 2.2 不同年龄段猪的PCV2感染 |
| 2.3 不同年份采集样品的PCV2抗体阳性率 |
| 2.4 浙江不同地区猪PCV2抗体阳性 |
| 2.5 猪的年龄、品种与PCV2血清阳性率 |
| 2.6 仔猪及种猪与PCV2血清阳性率 |
| 2.7 PCV2感染与PRV及PRRS疫苗免疫应答 |
| 2.8 同一猪群中PCV2感染与PRRSV感染相关性分析 |
| 3.讨论 |
| 第三章 人群及其他动物中PCV2相关抗体的血清学调查 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞、血清与试剂 |
| 1.2 人血清样本的收集 |
| 1.3 奶牛、鸡、鸭和山羊血清样本的收集 |
| 1.4 IFA试验 |
| 1.5 IPMA试验 |
| 1.6 人TTV、TTMV和猪TTV基因序列的收集和序列分析 |
| 1.7 人血清间接ELISA方法的建立 |
| 1.8 血清样品检测 |
| 1.9 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 研究人群的人口统计学 |
| 2.2 PCV2在师生中流行情况 |
| 2.3 不同年份收集血清PCV2相关抗体阳性率 |
| 2.4 不同地区PCV2相关抗体阳性率 |
| 2.5 PCV2相关抗体阳性率与年龄、性别、地区、HBV和ALT |
| 2.6 ALT和HBV检测结果 |
| 2.7 其他动物血清检测结果 |
| 2.8 人TTV、TTMV和猪TTV与PCV2的进化分析 |
| 2.9 间接ELISA最佳反应条件的优化 |
| 2.10 间接ELISA特异性敏感性试验 |
| 2.11 血清样品检测 |
| 3.讨论 |
| 第四章 PCV2感染性克隆及突变体的构建与体外复制能力研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 细胞、病毒与试剂 |
| 1.2 正常感染性克隆及突变体引物设计 |
| 1.3 病毒DNA模板制备 |
| 1.4 pMD18-T-PCV2重组质粒构建 |
| 1.5 单突变位点突变体的构建 |
| 1.6 双突变位点突变体的构建 |
| 1.7 DNA环化、细胞转染及检测 |
| 1.8 感染性试验和TCID_(50)测定 |
| 2.结果 |
| 2.1 PCV2分子克隆载体构建及鉴定 |
| 2.2 突变体的构建及鉴定 |
| 2.3 正常感染性克隆及各ORF缺失突变体PK-15细胞转染结果 |
| 2.4 正常感染性克隆及突变体在PK-15细胞上的感染性和复制能力 |
| 3.讨论 |
| 第五章 PCV2感染性克隆及其突变体对BALB/C小鼠致病性研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 细胞、毒株、试验动物、试剂 |
| 1.2 攻毒试验 |
| 1.3 感染性克隆及突变体体内致病性和凋亡性测定方案 |
| 2.结果 |
| 2.1 各组间PCV2抗体消长规律 |
| 2.2 小鼠感染后PCV2病毒血症的检测结果 |
| 2.3 接种小鼠脾脏的组织病理学观察结果 |
| 2.4 CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞测定结果 |
| 2.5 鼠脾脏内细胞凋亡流式分析结果 |
| 2.6 脾脏细胞内凋亡途经的检测结果 |
| 3.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 附录 |
| 附录A 常用试剂及仪器 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 |
| 附录C 攻博期间发表或录用的学术论文 |
| 致谢 |
四、山东地区TTV检测和部分基因克隆及序列测定（论文参考文献）
- [1]CCYV山东黄瓜分离物基因组结构特征及致病相关蛋白研究[D]. 干射香. 长江大学, 2020(02)
- [2]石河子及北屯地区猪TTV及PCV2的基因检测及基因型分析[D]. 施研进. 石河子大学, 2014(03)
- [3]昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究[D]. 张洪兵. 昆明理工大学, 2014(01)
- [4]猪圆环病毒2型遗传演化及含CpG基序的核酸疫苗研制[D]. 李俊. 山东师范大学, 2012(08)
- [5]猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析[D]. 赵玲. 四川农业大学, 2011(04)
- [6]猪输血传播病毒（TTV）与猪圆环病毒混合感染的检测及TTV遗传变异分析[J]. 刘建波,郭龙军,危艳武,黄立平,吴洪丽,刘长明. 中国预防兽医学报, 2011(01)
- [7]新型肝炎病毒研究策略与对策[A]. 于建国. 广东省肝脏病学会2007年年会论文集, 2007
- [8]圆环病毒2型感染的流行病学分析及其突变体致病性[D]. 陈庆新. 浙江大学, 2006(04)
- [9]山东泰安地区TTV检测和部分基因克隆及序列测定[J]. 于建国,商庆华,孙思才,任诰,肖德明,尹燕明. 山东医药, 2003(22)
- [10]山东地区输血传播病毒（TTV）检测及部分基因克隆和序列测定[J]. 于建国,商庆华,任诰,肖德明,尹燕明,白薇,戚中田,张光曙. 实用肝脏病杂志, 2003(01)