一、反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性的作用（论文文献综述）
樊祥奎[1]（2014）在《端粒酶催化亚基和PinX1基因在食管癌治疗中的生物学意义》文中提出研究背景：食管癌是一种常见的恶性肿瘤,中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一。食管癌的发生发展涉及多因素、多基因、多阶段,确诊时多为中晚期,预后极差,5年生存率仅为5%-20%。因此,探索食管癌的发病机制及安全有效的治疗方法成为食管癌治疗的关键。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进过程中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖及肿瘤的发生。端粒（telomere）作为分子钟控制着人类细胞的生长与衰老,与细胞寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA的长度会缩短55～200bp,经历多次分裂缩短至下限时,细胞最终凋亡。端粒酶（telomerase）是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。大量研究发现,在恶性肿瘤的发展中存在有端粒DNA长度的缩短,端粒酶的激活维持了癌细胞的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA的消耗,说明端粒酶在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有研究表明,人体除外少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞,大多数细胞的端粒酶都是无活性的,与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化在恶性肿瘤发生发展中起到了至关重要的作用,并且可以作为具有普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,则有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。端粒酶是由端粒酶RNA （hTR）,端粒酶催化亚基（hTERT）和端粒酶相关蛋白I （TEPI）三个亚单位组成。我们曾将互补于hTR模板区的反义寡核苷酸（ASODN）作用食管癌细胞（ECA109）,结果显示可抑制端粒酶活性,阻止细胞生长,但由于hTR广泛表达于正常组织细胞,针对hTR的反义治疗对正常组织细胞可能带来一定危害。新近的研究表明,hTERT是端粒酶的催化亚单位,在组织细胞中的表达量与端粒酶活性相平行,是影响端粒酶活性的最重要部分,也是端粒酶活性的限速因子,针对hTERT的反义治疗比对hTR治疗可能更有效,靶向hTERT基因治疗显然更为理想。其中重要的方法有反义核酸技术封闭、锤头状核酶切割和抑制hTERT的转录等。我们针对hTERT基因合成一段长19个碱基的反义寡核苷酸,硫化磷酸修饰（PS-ASODN）,脂质体包裹,转染食管癌细胞,研究其对食管癌端粒酶活性及癌细胞生长的影响。PinX1基因作为端粒酶的内源性基因,近几年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达水平明显下降,端粒酶活性增强。但到目前为止,PinX1基因在食管癌中的生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤有效手段,那么通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验研究采用RT-PCR,TRAP眼染法、MTT及流式细胞仪研究转染PinX1基因前后癌细胞增殖凋亡情况和端粒酶的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。以此证明PinX1基因是一个潜在的端粒酶活性抑制剂,可能通过靶向抑制端粒酶活性来影响肿瘤的发生发展,为食管癌的靶向基因治疗开辟新领域。目的：我们采用针对hTERT基因的全硫代修饰型反义寡核苷酸（PS-ASODN）转染于Eca-109人食管癌细胞,研究其对食管癌端粒酶活性及癌细胞生长的影响,探讨其对食管癌细胞的抑制作用及机理,寻找食管癌基因治疗的新方法。本实验成功构建PinX1基因表达载体pEGFP-C3-PinX1,将其转染有高转移潜能的Eca-109人食管癌细胞,观察转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响,同时应用TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,研究PinX1基因与端粒酶的关系,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。为食管癌的基因治疗提供理论依据。方法：1.端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用；采用MTT比色法测定PS-ASODN对Eca-109细胞的生长抑制率；采用倒置显微镜观察5μmol/L的PS-ASODN作用于Eca-109癌细胞10d后的细胞形态学改变；端粒酶活性检测采用半定量TRAP-银染法2基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响；利用分子生物学技术构建针对PinX1基因的表达载体pCDNA3.1-PinX1,采用脂质体LipofectamineTM2000包装形成的脂质体-RNA复合物,转染食管癌细胞Eca109,建立稳定表达PinX1的Eca109细胞模型,应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTT方法检测转染前后细胞增殖、FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR方法检测检测PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-银染法检测转染前后各组细胞端粒酶活性,阐明PinX1基因与端粒酶活化关系。结果：1.端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用；PS-ASODN对Eca-109细胞的生长抑制作用具有剂量及时间依赖性和序列特异性。PS-ASDON作用后,Eca-109细胞的生长速度缓慢,细胞间连接疏松,细胞变圆漂起,细胞体积缩小。随时间延长,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增强,呈时间-依赖性；随药物浓度增加,PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增,呈浓度-依赖性。2基因转染PinXl对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响；应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1-PinX1重组质粒成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞, MTT法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢（P<0.05）；而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异（P>0.05）。表明pCDNA3.1-Pinx1对Eca109细胞增殖呈显着的抑制作用,以细胞在不同时间点（oh!24h!48h!72h）的OD490值绘制细胞生长曲线,并计算出的生长抑制率,说明转染PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、TRAP-银染法和FCM检测结果显示,Eca109/PinX1细胞中PinXl mRNA和蛋白表达水平较pCDNA3.1组、空白细胞组显着升高（P<0.05）。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低（P<0.05）。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数（PI）表达呈正相关性（rs=0.451,P=0.000）。结论：针对hTERT的反义寡核苷酸能诱导食管癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒酶合成端粒,从而抑制食管癌细胞的生长,说明端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能有效地抑制肿瘤细胞的生长,为抗端粒酶的肿瘤基因治疗提供了实验基础。Eca109细胞转染PinX1基因后,外源PinX1基因可显着下调食管癌细胞中端粒酶活性及其hTERTmRNA表达,抑制肿瘤细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡。表明PinX1基因是一个潜在的端粒酶活性抑制剂,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。
刘飞[2]（2014）在《端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对乳腺癌细胞生物学特性及干细胞富集的影响》文中研究表明目的探讨人端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸（hTERT ASODN）对乳腺癌MCF-7细胞系干细胞微球体富集及其生物学特性的影响。方法以人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染,以正义序列转染作为对照。实验分设转染组（ASODN组）,正义序列转染的对照组（SODN组）及空白对照组。采用无血清悬浮培养法观察转染对MCF-7干细胞微球体富集的影响。Western blot检测各组干性标记物CD44及ALDH1的表达。RT-PCR检测各组ABCG2、MDR1 mRNA的表达。采用单因素方差分析对各组数据进行统计学处理。结果 ASODN组干细胞微球体生长速率及球体体积明显差于两对照组。与空白对照及SODN组比较,Western blot检测发现CD44与ALDH1在ASODN组细胞表达降低,差异有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR检测发现,在ASODN组细胞ABCG2及MDR1 mRNA的表达量均显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。而空白对照组及SODN组两者比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 hTERT ASODN在抑制乳腺癌干细胞微球体的富集、降低乳腺癌细胞干性表达及其耐药性方面具有重要作用。
李奇为[3]（2014）在《髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰对胆囊癌细胞化疗敏感性的影响和机制研究》文中研究表明胆囊癌细胞耐药,具有干细胞特性的胆囊癌侧群（side population,SP）细胞耐药性更强,是影响化疗疗效的主要原因之一。我们前期研究发现升高胆囊癌细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平能下调耐药相关蛋白、提高细胞对顺铂（CDDP）的敏感性,但ROS水平的升高如何促进耐药相关蛋白下调尚不清楚。研究提示,髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia 1,Mcl-1）是抗凋亡蛋白,可导致细胞化疗耐药,其稳定性受到氧化还原修饰—谷胱甘肽化修饰的调控。这提示我们升高ROS可能通过谷胱甘肽化修饰途径下调Mcl-1蛋白,逆转胆囊癌细胞耐药。但在胆囊癌细胞、尤其是SP细胞中,Mcl-1和CDDP耐药的关系,以及谷胱甘肽化修饰对Mcl-1的影响仍不清楚。本研究拟阐明Mcl-1在胆囊癌细胞、SP细胞CDDP耐药中的作用和谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的机制,并证明通过异硫氰酸苯乙酯（PEITC）增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰可加强胆囊癌细胞CDDP敏感性。此外,Mcl-1的转录因子信号传导与转录激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3）活性被报道也受到谷胱甘肽化修饰的调控,我们拟证明通过调控STAT3的谷胱甘肽化修饰可抑制Mcl-1蛋白生成、改善胆囊癌细胞CDDP耐药特性。第一部分:髓细胞白血病-1在胆囊癌细胞对顺铂耐药中的作用研究目的:研究胆囊癌细胞、胆囊癌SP细胞对CDDP耐药中Mcl-1蛋白的作用。方法:检测CDDP诱导下胆囊癌GBC-SD细胞Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1蛋白表达量变化。检测Mcl-1蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达差异。检测Mcl-1蛋白在人胆囊癌和慢性炎症胆囊组织中的表达差异。用siRNA下调Mcl-1蛋白表达,检测沉默Mcl-1蛋白对CDDP诱导细胞凋亡的影响。结果:1.CDDP特异性诱导胆囊癌细胞Mcl-1蛋白表达增加,并不增加Bcl-2、Bcl-x1蛋白表达。2.胆囊癌SP细胞中Mcl-1蛋白表达量明显高于非SP细胞。3.人胆囊癌组织Mcl-1蛋白表达率（71.4%）明显高于慢性炎症胆囊组织（26.7%）。4.沉默Mcl-1蛋白能显着增加CDDP诱导的细胞凋亡。结论:抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对CDDP耐药、胆囊癌SP细胞更耐药的原因之一。第二部分 异硫氰酸苯乙酯增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面观察Mcl-1靶向药物PEITC和CDDP治疗胆囊癌细胞的协同效应,并探讨机制。方法:分对照、PEITC、CDDP、PEITC/CDDP联合处理4组,处理胆囊癌GBC-SD细胞、胆管癌RBE细胞、胆囊癌SP细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术定量细胞凋亡率,试剂盒检测细胞caspase 3活性,western-blot检测细胞Mcl-1蛋白表达量。用胆囊癌GBC-SD细胞接种裸鼠28只建立荷瘤动物模型,成瘤达50mm3后随机分为对照、PEITC、CDDP、PEITC/CDDP联合处理4组,每组7只。腹腔给药10天后,观察裸鼠的体重以及移植瘤的重量和体积变化,western-blot检测移植瘤Mcl-1蛋白表达量。结果:1.PEITC能增加CDDP对胆囊癌细胞、胆管癌细胞、胆囊癌SP细胞的杀伤作用。2.PEITC能够促进CDDP抑制胆囊癌细胞移植瘤的生长,无明显毒副作用。3.PEITC能下调胆囊癌细胞、胆囊癌SP细胞、移植瘤中Mcl-1蛋白,PEITC/CDDP联合治疗组Mcl-1蛋白表达明显低于CDDP单用组。结论:在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面,PEITC均能通过下调Mcl-1蛋白从而增强CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。第三部分髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:阐明胆囊癌细胞中PEITC对Mcl-1谷胱甘肽化修饰的影响和谷胱甘肽化修饰对Mcl-1稳定性的调控。方法:使用PEITC处理胆囊癌GBC-SD细胞,观察其对细胞内Mcl-1 mRNA、还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化性谷胱甘肽（GSSG）比例、GSH水平、Mcl-1蛋白表达量、Mcl-1谷胱甘肽化修饰等的影响。并确定Mcl-1蛋白的谷胱甘肽化修饰位点,突变修饰位点致Mcl-1无谷胱甘肽化修饰后,观察突变是否影响PEITC下调Mcl-1蛋白。结果:1.PEITC通过蛋白酶体途径降解胆囊癌细胞Mcl-1蛋白。2.PEITC通过降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例从而降解Mcl-1蛋白。3.PEITC增加胆囊癌细胞内Mcl-1的谷胱甘肽化修饰。4.半胱氨酸16、286是Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点。5.突变谷胱甘肽化修饰位点能减慢PEITC降解Mcl-1蛋白。结论:1.PEITC能降低胆囊癌细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例,进而增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰,减弱蛋白稳定性,促进其被蛋白酶体降解,从而增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。2.此作用受半胱氨酸16、286两个Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点的调控。第四部分信号传导与转录激活因子3的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:阐明胆囊癌细胞中STAT3的谷胱甘肽化修饰对Mcl-1蛋白生成的调控及对化疗敏感性的影响。方法:使用丁硫氨酸-亚砜亚胺（L-Buthionine-sulfoximine,BSO）处理胆囊癌GBC-SD细胞,观察其对细胞内GSH/GSSG 比例、GSH水平、Mcl-1、STAT3蛋白表达量、STAT3谷胱甘肽化修饰等的影响。分对照、BSO、CDDP、BSO/CDDP联合处理4组,处理胆囊癌GBC-SD细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术定量细胞凋亡率,试剂盒检测细胞caspase 3活性。结果:1.BSO抑制胆囊癌细胞STAT3激活并下调Mcl-1蛋白表达。2.BSO明显降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例。3.BSO增加STAT3的谷胱甘肽化修饰。4.BSO增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。结论:BSO增加STAT3的谷胱甘肽化修饰,抑制其激活从而抑制下游Mcl-1蛋白生成,增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。总之,本实验揭示了抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对CDDP耐药、胆囊癌SP细胞更耐药的新原因;发现了谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的新机制:Mcl-1谷胱甘肽化修饰的增加会减弱蛋白稳定性,促其被蛋白酶体降解;首次证实了半胱氨酸16、286是Mcl-1的谷胱甘肽化修饰位点;PEITC通过调控Mcl-1谷胱甘肽化修饰促其降解,增加CDDP杀伤作用经过了肿瘤细胞系、SP细胞和裸鼠移植瘤模型的验证,安全有效,有较好的临床应用价值。此外,通过增加STAT3谷胱甘肽化修饰从而抑制下游Mcl-1蛋白生成,也能增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。
杨蓉娟,许艳蕾,刘雪琴,魏丽莉[4]（2012）在《端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌细胞株的影响》文中研究表明目的观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对癌细子宫内膜癌细胞株的作用。方法用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与子宫内膜细胞株共同温育一定时间后,观察细胞形态变化,检测细胞Bcl-2蛋白表达情况,测定端粒酶活性。结果端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导子宫内膜癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为出现细胞质浓缩,变圆,核染色不均匀,核物质边聚成新月形或块壮;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,反义寡核苷酸在细胞进入DNA合成期前引起DNA损伤,使细胞停滞在G0～G1期,并诱导细胞凋亡。结论端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能抑制端粒酶活性,诱导子宫内膜癌细胞凋亡,从而抑制子宫内膜癌的增殖。
王菲[5]（2012）在《hTERT pre-mRNA选择性剪接在调控胶质瘤端粒酶活性中作用的研究》文中提出研究目的:端粒是控制细胞增殖与衰老凋亡的生物钟,分化成熟的正常人体细胞不表达端粒酶,因次端粒随细胞分离次数增加逐渐缩短。端粒酶异常再表达及活化与细胞恶性转化密切相关,约90%以上恶性肿瘤有端粒酶再表达及活化。人端粒酶逆转录酶（hTERT）是人端粒酶的催化亚单位及决定其活性的关键因素。hTERT对端粒酶活性的调控分为转录水平调控和hTERT pre-mRNA选择性剪接调控,即转录后水平调控。α和β两个位点的缺失是目前hTERT pre-mRNA剪接调控中研究较多的位点。hTERT pre-mRNA序列上存在着外显子剪接增强子（ESE）序列,反义寡核苷酸与之相结合可诱导外显子跳跃,改变选择性剪接模式。本研究应用反义寡核苷酸与hTERT pre-mRNA中的外显子剪接增强子结合,调控其剪接模式,减少全长型hTERT mRNA的表达,抑制端粒酶活性,从而影响胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。旨在探讨hTERT pre-mRNA的选择性剪接对端粒酶活性的调节作用,为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据。研究方法:第一部分:以胶质瘤细胞系和胶质瘤组织标本为研究对象,采用RT-PCR方法检测hTERT选择性剪接变异体,用TRAP方法检测端粒酶活性,分析hTERT选择性剪接变异体和端粒酶活性的关系。第二部分:应用ESEfinder3.0软件分析hTERT pre-mRNA序列上外显子剪接增强子（ESE）的位点,特别是对外显子5～外显子9之间的序列进行预测分析,以获得分值较高,即ESE概率较大的位点。根据ESE序列设计并合成与其互补的反义寡核苷酸,将其转染U251胶质瘤细胞,探讨不同化学修饰结构对胶质瘤细胞端粒酶活性及端粒长度的影响。第三部分:应用TRAP法、TRF法检测经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的端粒酶活性及端粒长度;应用MTT法、平板克隆形成实验、PI染色细胞周期测定、单细胞凝胶电泳、DNALadder实验、Annexin V/PI双染色细胞凋亡检测法、2DMatrigel实验、3DMatrigel实验、Transwell实验等,分析经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的增殖、凋亡和侵袭能力的变化;应用Western blot技术检测与肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达变化情况;观察经反义寡核苷酸长时程处理后U87细胞干细胞神经球的形成情况,及用TRAP法、TRF法检测U87干细胞的端粒酶活性及端粒长度。结果:第一部分:胶质瘤组织中及胶质瘤细胞系内均存在hTERT选择性剪接变异体表达。端粒酶活性和全长型hTERTmRNA表达相对量存在相关性,而总hTERT mRNA与端粒酶活性无相关性。第二部分:设计合成的2’-氧-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸可调节hTERT pre-mRNA的剪接作用,产生外显子跳跃;使hTERT外外显子7和外显子8丢失,减少了全长型hTERT mRNA的表达,而增加了 β缺失型hTERT mRNA的表达;降低了 U251胶质瘤细胞的端粒酶活性。第三部分:经反义寡核苷酸长时程处理的U251细胞端粒酶活性降低,端粒长度缩短,增殖活性受到抑制,细胞凋亡显着增加,侵袭能力明显减弱,肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达明显下调;经反义寡核苷酸长时程处理的U87细胞干细胞神经球形成不良,干细胞的端粒酶活性降低,端粒长度缩短。结论:1.hTERT pre-mRNA存在选择性剪接现象,可生成多种剪接变异体。总hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性并不是一一对应的关系,只有全长型hTERT蛋白具有促端粒酶活性。2.hTERT pre-mRNA序列上存在ESE位点,与之互补的2’-氧甲基硫代磷酸酯反义寡核苷酸可调控hTERT pre-mRNA选择性剪接模式,介导hTERT pre-mRNA外显子跳跃,减少全长型hTERT mRNA的表达,增加β缺失型hTERT mRNA的表达,从而抑制胶质瘤细胞的端粒酶活性。3.反义寡核苷酸通过改变hTERT pre-mRNA的选择性剪接模式抑制端粒酶活性,缩短端粒长度,使细胞增殖能力减弱,使肿瘤细胞凋亡明显,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力。使胶质瘤干细胞的增殖能力减弱,端粒酶活性降低、端粒长度变短。4.本研究可为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据,为胶质瘤基因治疗提供新的靶点及重要线索,可能成为将来胶质瘤治疗的有效策略之一。
李靓,李洋,王继见[6]（2010）在《hTR反义寡核苷酸对结直肠癌SW480细胞的凋亡及凋亡诱导因子表达的影响》文中提出目的探讨封闭人端粒酶RNA功能区的反义寡核苷酸（human telomerase RNA antisense oligonucleotide,hTR ASODN）对结直肠癌SW480细胞凋亡及凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）表达的影响。方法通过脂质体将hTR ASODN1次/d,连续3d转染入人结直肠癌SW480细胞,以未加ASODN的脂质体空白组及脂质体转染的正义组为对照。荧光显微镜观察转染情况,流式细胞仪测定转染后SW480细胞的凋亡率,RT-PCR法测定转染后AIF的表达情况。结果 hTR ASODN转染细胞后,倒置显微镜下观察各组细胞,细胞内有绿色荧光均匀分布表示转染良好。流式细胞仪测定转染24、48、72h后,各实验组凋亡率分别为:空白组（3.07±0.11）%、（3.71±0.63）%、（4.23±0.41）%,正义组（4.28±0.41）%、（4.49±0.56）%、（5.13±0.56）%,反义组（13.11±0.32）%、（22.04±0.21）%、（16.71±0.82）%,反义组分别与空白组、正义组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。空白组、正义组、反义组光密度比值分别为（0.1527±0.0021）、（0.1580±0.0078）、（0.3683±0.0109）,反义组分别与空白组、正义组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 hTR ASODN具有明显的促进凋亡、抗肿瘤作用。
黄金,张胜平,邓兴力,杨智勇[7]（2010）在《胶质瘤的端粒酶研究进展》文中指出端粒、端粒酶的研究是分子细胞生物学以及医学的热点之一。端粒酶的生物活性机制被认为是细胞获得永生化的必要途径,是恶性转化的基础,与细胞的衰老、肿瘤发生密切相关。随着对端粒酶的结构及其在正常和肿瘤组织细胞的调控机制的理解和认识,靶向端粒酶的胶质瘤治疗将是今后研究的重点。现就近几年反义寡核苷酸、RNA干扰、核酸、基因方面、反转录酶抑制剂等对端粒酶的作用影响予以综述。
倪伟民,郭闻师,衣服新,邱建武,刘兴波[8]（2010）在《全硫代反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞端粒酶活性作用》文中研究表明目的本研究采用针对人端粒酶hTR基因的反义寡聚脱氧核苷酸,探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxy nucleotides,ASODN）对脑胶质瘤HO-8910细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。方法本实验将互补于hTR模板区的全硫代修饰型反义寡核苷酸（PS-ASODN）经lipotap脂质体转染作用于脑胶质瘤细胞系C6,然后分别采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验、酶联免疫吸附试验（ELISA）法和流式细胞术检测C6脑胶质瘤细胞的体外增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变。结果经MTT法检测,PS-ASODN对C6细胞生长具有明显的抑制作用和诱导细胞凋亡,1.0μMPS-ASODN处理后24h细胞生长抑制率为12.93%,且随着时间的延长,抑制作用逐渐增强;给药72h对细胞生长抑制率达到最高,为50.81%,有相应的浓度依赖关系。ELISA法检测结果 ,0.5～1.5μM的PS-ASODN对C6细胞作用72h后端粒酶皆为阴性,表明PS-ASODN能够抑制端粒酶活性,对照组端粒酶皆为阳性。结论端粒酶PS-ASODN对体外培养的脑胶质瘤C6细胞的增殖有明显的浓度、时间依赖性抑制作用;抑制脑胶质瘤C6的端粒酶活性和诱导C6脑胶质瘤细胞发生凋亡,可能是端粒酶PS-ASODN抑制C6细胞增殖的主要机制。
曲华伟[9]（2010）在《RNAi抑制人胆囊癌VEGF基因表达及其对胆囊癌细胞生长与侵袭影响的实验研究》文中提出研究背景原发性胆囊癌是胆道系统中占首位的恶性肿瘤,在消化道恶性肿瘤中占第5位。胆囊癌恶性程度极高,早期无特异表现,很多病人在诊断时已进展至晚期。胆囊癌治疗以手术治疗仅只有20%-30%的患者可以得到根治性切除,其对于化疗和放疗均不敏感。探索胆囊癌的基因治疗具有积极意义。实体肿瘤是血管依赖性病变,其生长、浸润和转移离不开血管生成。VEGF是目前已知肿瘤血管生成因子中直接刺激内皮细胞分裂增殖的血管内皮细胞有丝分裂原。VEGF的表达在胆囊癌大小、淋巴浸润各阶段有显着的不同。胆囊癌细胞分泌VEGF增加,除可以促进新生血管形成,还可以加速肿瘤演进。VEGF不但与胆囊癌的发生相关,还与胆囊癌浸润、转移及预后密切相关。针对VEGF抗胆囊癌血管形成的治疗研究具有重要意义。肿瘤治疗的关键是有效抑制VEGF基因表达。现在,可以下调VEGF基因表达的技术包括反义核酸技术、核酶技术以及RNA干扰技术。反义技术和核酶技术的基因抑制效果十分短暂、微弱,不适合长期研究基因功能。RNA干扰技术抑制效果强,持续时间长,技术流程简便,其表达非常稳定。本实验的基本思路是：通过构建针对人VEGF基因的shRNA干扰质粒载体,观察沉默VEGF基因对胆囊癌GBC-SD细胞生长和侵袭能力的影响；建立稳定转染shRNA-VEGF的细胞株,通过检测其VEGF受体表达变化,初步探讨VEGF与VEGF受体的相互作用；应用胆囊癌GBC-SD细胞株以及稳定转染细胞株分别建立胆囊癌的裸鼠移植瘤模型,观察各组细胞的成瘤能力。另一组动物实验中,向正常胆囊癌裸鼠移植瘤瘤内注射干扰质粒shRNA-VEGF2,观察其对裸鼠移植瘤VEGF基因表达的影响及对肿瘤的生长与血管生成的抑制作用,通过应用RNA干扰技术抑制胆囊癌VEGF基因表达从而抑制胆囊癌肿瘤生长与侵袭,为这一技术的临床应用提供实验和理论基础。目的：构建针对人胆囊癌VEGF基因的shRNA及其质粒表达载体。方法：设计针对人VEGF基因序列的4组寡核苷酸链模板,退火后与载体质粒pCY/U6/GFP/Neo连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果：酶切鉴定和DNA测序分析后,表明靶向VEGF的RNA干扰质粒载体构建成功。结论：成功构建针对人VEGF基因的shRNA表达载体pCY/U6/GFP/Neo-shRNA-VEGF。目的：将干扰质粒转染人胆囊癌细胞,观察其对VEGF基因沉默的效果,并采用荧光素酶报告基因验证RNA干扰位点的有效性。筛选出干扰效果最好的质粒并建立稳定转染细胞株。观察VEGF受体表达变化,初步探讨VEGF与VEGF受体之间的作用机制。方法：①干扰质粒转染胆囊癌GBC-SD细胞,分别采用半定量PCR、实时荧光定量PCR和Western印迹方法检测VEGF mRNA和蛋白表达情况,筛选出抑制靶基因表达效果最好的质粒；②因RNA干扰可能存在“脱靶效应”,为验证RNA干扰位点的准确性,我们设计含有VEGF靶位点的引物,将其与荧光素酶报告基因载体退火连接,再将其与第一部分的干扰质粒共转染人胆囊癌细胞,观察荧光素酶活性变化,明确RNA干扰位点的有效性；③将干扰效率最高的的表达质粒用来建立稳转细胞株。同时用NC表达质粒作为阴性对照稳转细胞株。经G418筛选,建立两个稳转细胞株,分别称为GBC-shV2和GBC-NC;④采用实时荧光定量PCR检测稳定转染细胞株的三种VEGF受体（Flt-1、KDR、NRP-1）的mRNA表达变化情况,并加入外源性VEGF因子到稳转细胞株中,分别检测24,48,72小时VEGF受体的表达变化情况。初步探讨VEGF与其受体之间的作用机制。结果：干扰质粒转染胆囊癌GBC-SD细胞后,半定量PCR检测显示,shVEGF1、shVEGF2、shVEGF3、shVEGF4干扰质粒对靶基因mRNA表达都有抑制作用,其中shVEGF2干扰质粒抑制作用最明显,抑制率达64%,与空白对照组相比,具有明显差异（P<0.05）；实时荧光定量PCR检测显示,shVEGF1、shVEGF2. shVEGF3干扰质粒对靶基因mRNA表达都有抑制作用,其中shVEGF2干扰质粒抑制作用最明显,抑制率达83%,与空白对照组相比,具有明显差异（P＜0.05）; Western blot方法检测各组细胞中VEGF蛋白表达水平显示,shVEGF1、shVEGF2干扰质粒对靶基因蛋白表达有抑制作用,其中shVEGF2干扰质粒抑制作用最明显,抑制率达92%,与空白对照组相比,具有明显差异（P<0.05）。可见shVEGF2干扰质粒对VEGF基因表达抑制最明显；②通过荧光素酶报告基因验证实验,我们发现含有VEGF2靶位点的荧光素酶报告基因载体被shRNA-VEGF2成功干扰,与对照组比较,荧光素酶活性下降75%,有统计学意义（P<0.05）；③成功建立两个分别表达shRNA-VEGF2和NC质粒的稳转细胞株,分别命名为GBC-shV2和GBC-NC细胞。④实时荧光定量PCR检测显示,相对于阴性稳转细胞株,GBC-shV2细胞株中的Flt-1与KDR受体表达分别下降28%和18%,而NRP-1受体表达升高47%。我们将外源性VEGF因子加入稳转细胞株中,检测Flt-1受体表达变化：相对于阴性稳转细胞株,24小时表达75%,48小时表达183%,72小时表达411%。可见,外源性VEGF因子加入后,Flt-1受体mNRA的表达呈明显上升的趋势。结论：①shRNA-VEGF2干扰质粒可以明显抑制人胆囊癌细胞VEGF基因mRNA和蛋白的表达；②经荧光素酶报告基因实验证明RNA干扰的VEGF基因序列的靶位点是准确有效的；③成功建立稳定表达shRNA-VEGF2质粒的细胞株；④人胆囊癌GBC-SD细胞存在VEGF的受体（Flt-1、KDR、NRP-1）；⑤胆囊癌细胞VEGF蛋白可能存在自分泌机制；⑥VEGF可能对其Flt-1受体的表达有诱导作用。目的：通过对前面试验得到的稳定转染细胞株进行相关的生物学实验,探讨沉默VEGF基因对人胆囊癌GBC-SD细胞生长、黏附、迁移运动及侵袭能力的影响。方法：本实验采用的细胞株分别是正常胆囊癌细胞株GBC-SD以及前面试验得到的稳定转染细胞株GBC-shV2和GBC-NC。在本部分实验中拟采用MTT法绘制胆囊癌细胞的生长曲线；通过肿瘤细胞与细胞基质黏附实验以及肿瘤细胞与内皮细胞黏附实验,测定细胞不同吸光度值,评估胆囊癌细胞黏附能力变化；通过肿瘤细胞迁移运动实验,对比肿瘤细胞不同的迁移距离,评估胆囊癌细胞迁移运动能力变化；通过Transwell小室侵袭实验法,计算穿透膜的细胞数,评估胆囊癌细胞侵袭能力变化。结果：①从生长曲线看,GBC-shV2细胞与GBC-SD细胞相比,增殖生长明显变慢,细胞活力下降明显,达36%,差异有统计学意义（p<0.05）。而GBC-NC细胞的生长速度和GBC-SD没有区别（p>0.05）；②与GBC-SD细胞相比,GBC-shV2细胞与细胞外基质黏附率明显下降,达55%（p<0.05）,与内皮细胞黏附率明显下降,达60%（p<0.05）,而GBC-NC细胞与细胞外基质和内皮细胞的黏附率与GBC-SD细胞相比没有明显区别（p>0.05）；③与GBC-SD细胞相比,GBC-shV2细胞迁移运动距离明显减少,达61%（p<0.05）,而GBC-NC细胞与与GBC-SD细胞相比没有明显区别（p>0.05）；④与GBC-SD细胞相比,GBC-shV2细胞穿透膜的细胞数明显减少,减少达51%（p<0.05）,而GBC-NC细胞与与GBC-SD细胞相比没有明显区别（p>0.05）。结论：shRNA-VEGF干扰质粒能抑制胆囊癌细胞生长,可能使胆囊癌细胞的黏附,迁移运动以及侵袭能力降低。目的：应用胆囊癌GBC-SD细胞及稳转细胞株分别建立裸鼠移植瘤模型,观察其成瘤能力变化；瘤内注射重组质粒shRNA-VEGF2,观察对其裸鼠移植瘤VEGF基因表达的影响以及对肿瘤的生长与血管生成的抑制作用。方法：本实验分为裸鼠成瘤实验与荷瘤裸鼠治疗实验两部分。裸鼠成瘤实验：分别将GBC-SD, GBC-shV2, GBC-NC细胞建立裸鼠移植瘤模型,观察其成瘤时间,成瘤率,肿瘤体积变化,绘制生长曲线。荷瘤裸鼠治疗实验：首先建立正常胆囊癌GBC-SD细胞裸鼠异位移植瘤。分别将不同试剂（干扰质粒,空白质粒,培养液,转染试剂）多点多次注射入瘤内,观察肿瘤体积变化。动物实验结束后,进行肿瘤组织免疫组化检测。分别测定VEGF蛋白的积分光密度（IOD）与组织微血管密度（MVD）。结果：①裸鼠成瘤实验：GBC-shV2细胞成瘤时间在12.7天,成瘤率67%,肿瘤体积抑制率70%。GBC-shV2细胞组肿瘤组织无明显出血及坏死,肿瘤与周围组织粘连较松,易剥离；相对于GBC-SD细胞组,GBC-shV2组肿瘤组织VEGF蛋白的IOD值下降59%（p<0.05）,MVD值下降64%（p<0.05）。②荷瘤裸鼠治疗实验：与注射培养液组（A组）相比较,注射shRNA-VEGF2质粒组（D组）的肿瘤体积明显减小,体积抑制率为45%；与A组比较,D组肿瘤组织VEGF的IOD值下降50%（p<0.05）,MVD值下降59%（p<0.05）。结论：针对人胆囊癌GBC-SD细胞VEGF基因的RNA干扰技术可以显着抑制胆囊癌移植瘤中VEGF基因的表达,可以明显抑制胆囊癌移植瘤中的新生血管生成,从而间接抑制胆囊癌移植瘤的生长。目的：以VEGF-A的生物序列为基础,对其进行生物信息学分析。方法：首先以Phylip和Treeview软件绘制该VEGF-A系统进化树；以ExPASY网站提供的生物信息学分析模块和分析软件对VEGF-A的理化性质进行分析；预测VEGF-A的二级结构；使用ExPASy网站上SWISSMODEL模块进行VEGF-A蛋白的三级结构预测,使用STRING网站上Protein-Protein Interactions模块进行VEGF-A蛋白的四级结构（蛋白质相互作用）预测分析。结果：①从VEGF-A系统进化树可以看出,斑马鱼分支起源最早,然后依次是狗,马,猪等分支,人VEGF-A的进化发源得比较晚；②VEGF-A蛋白所带总负电荷残基数为2,所带总正电荷残基数为37,VEGF-A的等电点分别是12.38和12.9,这说明VEGF-A是一种带正电的蛋白质。VEGF-A蛋白的亲水指数为-0.605,这说明VEGF-A蛋白是一种疏水性的蛋白质。VEGF-A的不稳定指数为31.26,可以看出VEGF是比较稳定蛋白；③GOR4、HNN、SOPMA三种方法预测的二级结构都认为第55-60、65-70、98-108位等区域可能是VEGF-A的功能结构域。分析VEGF-A的亲水性、极性以及折返系数可以发现,第6-12、55-65、132-138、150-157位等区域可能是VEGF-A的功能结构域。与VEGFA有相互作用联系的蛋白质有十种,分别是Flt-1,KDR,NRP-1,NRP-2,免疫球蛋白K轻链基因片段C区,Src,N0S3, ARNT, VTN, HIF1A。结论：VEGF-A蛋白是一种带正电荷的稳定的疏水性蛋白。第55-60位区域可能是VEGF-A的功能结构域。
邓志华,杨长青,刘燕,刘金龙,杨强,赵婕,韩子岩,曹燕[10]（2009）在《端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验》文中研究说明目的研究端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞株的凋亡诱导作用及其机制。方法以人肝癌细胞株SMMC-7721、正常肝细胞株L-02为研究对象,采用TRAP-ELISA法对肿瘤细胞端粒酶活性进行定性定量分析;细胞形态学、TUNEL染色、DNA琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用,用流式细胞仪对细胞周期进行时相分析,Western杂交对细胞周期蛋白进行研究。结果一定浓度的端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性,肝癌细胞端粒酶活性被抑制后传代23～26次出现细胞凋亡。细胞凋亡与细胞周期蛋白有关。结论端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性并诱导其凋亡。
二、反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性的作用（论文提纲范文）
（1）端粒酶催化亚基和PinX1基因在食管癌治疗中的生物学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 端粒酶催化亚基hTERT反义寡核苷酸对食管癌细胞抑制作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 端粒酶抑制因子PinX1基因在食管癌细胞中的表达及作用效应分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（2）端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对乳腺癌细胞生物学特性及干细胞富集的影响（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 1.主要试剂: |
| 2.主要仪器: |
| 二、方法 |
| 1.细胞培养液的制备: |
| 2.细胞培养: |
| 3.脂质体介导的寡核苷酸 (ODN) 转染: |
| 4.MCF-7干细胞微球体悬浮培养: |
| 5.RT-PCR检测ABCG2及MDR1 mRNA的表达: |
| 6.Western blot检测CD44及ALDH1的蛋白表达: |
| 三、统计学分析 |
| 结果 |
| 一、乳腺癌干细胞微球体无血清悬浮培养观察 |
| 二、RT-PCR检测ASODN转染对乳腺癌MCF-7细胞ABCG2及MDR1 mRNA表达的影响 |
| 三、Western blot检测ASODN转染对乳腺癌MCF-7细胞CD44及ALDH1蛋白表达的影响 |
| 讨论 |
（3）髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰对胆囊癌细胞化疗敏感性的影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文缩略语中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 髓细胞白血病-1在胆囊癌细胞对顺铂耐药中的作用研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 异硫氰酸苯乙酯增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 信号传导与转录激活因子3的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（4）端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌细胞株的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 HTERT反义寡核苷酸的设计合成 |
| 1.2 子宫内膜癌细胞株 |
| 1.3 细胞培养与转染 |
| 1.4 端粒酶活性 |
| 1.5 Giemsa染色法观察细胞凋亡 |
| 1.6 DNA ladder测定 |
| 1.7 Bcl-2蛋白定量检测 |
| 1.8 流式细胞仪分析 |
| 1.9 凋亡细胞和细胞周期的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态学变化 |
| 2.2 DNA Ladder 检测 |
| 2.3 流式细胞仪检测细胞Bcl-2蛋白表达情况 |
| 3 讨论 |
（5）hTERT pre-mRNA选择性剪接在调控胶质瘤端粒酶活性中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、胶质瘤端粒酶活性与hTERT剪接变异体表达的相关性研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 材料 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 胶质瘤组织HE染色的病理特点 |
| 1.2.2 胶质瘤细胞系hTERT ASVs表达及端粒酶活性检测结果 |
| 1.2.3 胶质瘤细胞系hTERT ASVs表达与端粒酶活性的相关性 |
| 1.2.4 胶质瘤组织中hTERT ASVs表达与端粒酶活性的相关性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 端粒及端粒酶的结构和功能 |
| 1.3.2 hTERT及hTERT pre-mRNA的选择性剪接 |
| 1.3.3 hTERT ASVs表达与端粒酶活性的关系 |
| 1.4 小结 |
| 二、反义寡核苷酸的设计合成及对hTERT剪接和端粒酶活性的调控作用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 材料 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 ESEFinder3.0预测hTERT pre-mRNA外显子剪接增强子 |
| 2.2.2 反义寡核苷酸转染U251胶质瘤细胞转染效率的评估 |
| 2.2.3 不同寡核苷酸对U251胶质瘤细胞生长的影响 |
| 2.2.4 反义寡核苷酸转染U251细胞对hTERT剪接变异体的影响 |
| 2.2.5 反义寡核苷酸转染U251细胞对端粒酶活性的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 ESEFinder预测外显子剪接增强子 |
| 2.3.2 反义寡核苷酸介导的外显子跳跃 |
| 2.3.3 反义寡核苷酸影响hTERT pre-mRNA选择性剪接调控端粒酶活性 |
| 2.4 小结 |
| 三、反义寡核苷酸对胶质瘤细胞增殖凋亡侵袭及其干细胞的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要实验试剂和材料 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 端粒酶活性检测结果 |
| 3.2.2 端粒长度检测结果 |
| 3.2.3 MTT法细胞增殖能力检测结果 |
| 3.2.4 平板克隆形成实验检测结果 |
| 3.2.5 流式细胞仪分析细胞周期结果 |
| 3.2.6 单细胞凝胶电泳检测结果 |
| 3.2.7 DNA ladder检测结果 |
| 3.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 3.2.9 细胞体外粘附实验结果 |
| 3.2.10 细胞体外基质降解实验结果 |
| 3.2.11 细胞体外侵袭实验结果(Transwell实验) |
| 3.2.12 Western blot检测蛋白表达的结果 |
| 3.2.13 反义寡核苷酸对胶质瘤干细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 反义寡核苷酸对胶质瘤细胞增殖的调控 |
| 3.3.2 反义寡核苷酸对胶质瘤细胞凋亡的调控 |
| 3.3.3 反义寡核苷酸对胶质瘤细胞侵袭迁移的调控 |
| 3.3.4 反义寡核苷酸对胶质瘤干细胞的影响 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 端粒与端粒酶及其在干细胞中的作用研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（6）hTR反义寡核苷酸对结直肠癌SW480细胞的凋亡及凋亡诱导因子表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞的培养及传代 |
| 1.2.2 脂质体介导的正反义寡核苷酸的转染 |
| 1.2.3 实验分组 |
| 1.2.4 细胞转染后的观察 |
| 1.2.5 流式细胞仪检测转染后的细胞凋亡率 |
| 1.2.6 RT-PCR技术检测AIF的表达 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 hTR ASODN转染的荧光摄像 |
| 2.2 流式细胞仪测定凋亡率 |
| 2.3 RT-PCR检测结果 |
| 3 讨论 |
（7）胶质瘤的端粒酶研究进展（论文提纲范文）
| 1 端粒及端粒酶的生物学特性 |
| 3 以端粒酶为靶点治疗胶质瘤 |
| 3.1 反义寡核苷酸 |
| 3.2 RNA干扰 |
| 3.3 核酶 |
| 3.4 原癌基因及抑癌基因对端粒酶的作用 |
| 3.53′-2叠氮胸苷 |
| 3.6 其他抑制剂对端粒酶活性的影响 |
| 4 问题与展望 |
（8）全硫代反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞端粒酶活性作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞株及试剂 |
| 1.2 实验分组和细胞培养 |
| 1.3 寡核苷酸的配制和转染 |
| 1.4 MTT检测细胞活性 |
| 1.5 端粒酶活性检测 |
| 1.6 细胞爬片 |
| 1.7 流式细胞仪染色 |
| 2 结果 |
| 2.1 端粒酶PS-ASODN对脑胶质瘤细胞的生长抑制作用 |
| 2.2 脑胶质瘤细胞端粒酶活性检测结果 |
| 2.3 流式细胞仪PI染色结果 |
| 2.4 Annexin V-FITC/PI双染结果 |
| 3 讨论 |
（9）RNAi抑制人胆囊癌VEGF基因表达及其对胆囊癌细胞生长与侵袭影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 shRNA-VEGF质粒表达载体的构建 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 shRNA-VEGF对人胆囊癌细胞VEGF基因沉默作用的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 shRNA-VEGF对胆囊癌细胞生长及侵袭能力抑制的体外研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 VEGF-shRNA对胆囊癌增殖及血管形成的体内研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 VEGF蛋白的生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 课题创新性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| VEGF与胆囊癌 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文及获奖情况 |
（10）端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 合成反义、正义、随机序列DNA作用不同时间对肝癌细胞株SMMC-7721端粒酶活性的影响 |
| 2.2 反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用 |
| 2.2.1 TUNEL标记 |
| 2.2.2 DNA电泳 |
| 2.2.3 端粒酶活性与细胞周期的关系 |
| 2.3 细胞周期调控因子检测结果 |
| 3 讨论 |
四、反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性的作用（论文参考文献）
- [1]端粒酶催化亚基和PinX1基因在食管癌治疗中的生物学意义[D]. 樊祥奎. 山东大学, 2014(04)
- [2]端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对乳腺癌细胞生物学特性及干细胞富集的影响[J]. 刘飞. 中华临床医师杂志(电子版), 2014(15)
- [3]髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰对胆囊癌细胞化疗敏感性的影响和机制研究[D]. 李奇为. 上海交通大学, 2014(05)
- [4]端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌细胞株的影响[J]. 杨蓉娟,许艳蕾,刘雪琴,魏丽莉. 河北医药, 2012(17)
- [5]hTERT pre-mRNA选择性剪接在调控胶质瘤端粒酶活性中作用的研究[D]. 王菲. 天津医科大学, 2012(08)
- [6]hTR反义寡核苷酸对结直肠癌SW480细胞的凋亡及凋亡诱导因子表达的影响[J]. 李靓,李洋,王继见. 第三军医大学学报, 2010(22)
- [7]胶质瘤的端粒酶研究进展[J]. 黄金,张胜平,邓兴力,杨智勇. 医学综述, 2010(13)
- [8]全硫代反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞端粒酶活性作用[J]. 倪伟民,郭闻师,衣服新,邱建武,刘兴波. 解剖科学进展, 2010(03)
- [9]RNAi抑制人胆囊癌VEGF基因表达及其对胆囊癌细胞生长与侵袭影响的实验研究[D]. 曲华伟. 中南大学, 2010(11)
- [10]端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验[J]. 邓志华,杨长青,刘燕,刘金龙,杨强,赵婕,韩子岩,曹燕. 肿瘤防治研究, 2009(03)