一、人胰岛素样生长因子Ⅱ基因P1、P3启动子克隆及意义（论文文献综述）
周秋至[1]（2019）在《糖原合酶激酶-3β乙酰化以及孕期环境丰富在阿尔兹海默病样神经损伤或保护中的作用及机制研究》文中研究说明背景:阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是一种神经退行性疾病,该疾病最相关的组织病理学标志是由β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein,Aβ）组成的细胞外老年斑和主要由过度磷酸化的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）。糖原合酶激酶-3（Glycogen synthase kinase-3,GSK-3）在神经系统中广泛表达。糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）是GSK-3的一个重要亚型。糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）过度激活可导致Tau蛋白过度磷酸化、突触损伤和学习记忆障碍,在AD的发生发展中起重要作用。然而,GSK-3β在AD进程中持续激活的机制尚不清楚。本实验室前期研究发现在AD转基因小鼠中GSK-3β乙酰化水平升高,但GSK-3β乙酰化在AD发生发展中的作用及其升高的机制尚不清楚。目的:探索GSK-3β乙酰化在AD的发生发展中的作用及其潜在的分子机制方法:在过表达Tau蛋白的HEK293细胞模型中,通过质谱分析确定GSK-3β乙酰化显着升高的位点,并制备特异性抗体,用该抗体检测AD模型动物中GSK-3β该位点的乙酰化水平;在多种细胞系中过表达GSK-3β赖氨酸15位点模拟乙酰化点突变质粒,运用GSK-3β酶活性检测法,蛋白免疫印迹,免疫沉淀,免疫组织化学技术检测GSK-3β赖氨酸15位点模拟乙酰化后对其蛋白激酶活性,蛋白表达水平,泛素化水平及降解曲线的影响。在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3β赖氨酸15位点模拟乙酰化点突变腺相关病毒,运用小鼠行为学,蛋白免疫印迹,免疫沉淀,免疫组织化学,免疫荧光等技术对小鼠的学习记忆及情绪,Tau蛋白的磷酸化,神经炎症相关因素（小胶质细胞和星形胶质细胞激活情况）以及突触相关蛋白的表达水平进行检测。在多种细胞系中过表达Tau全长及乙酰转移酶活性区域缺失的Tau-k18（-）质粒,运用蛋白免疫印迹,免疫沉淀,免疫组织化学技术检测Tau乙酰转移酶活性对GSK-3β蛋白水平,乙酰化水平,泛素化水平及降解曲线的影响。运用纯化蛋白进行体外乙酰化的实验来验证Tau对GSK-3β的直接乙酰化作用。结果:1、在多种AD样细胞和小鼠模型中均可见GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化水平升高通过质谱分析确定在HEK293转Tau模型中GSK-3β赖氨酸15位点存在乙酰化修饰,根据该结果制备特异性的识别GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化的抗体,并用该抗体检测多种AD模型动物（3x Tg,APP/PS1,Tau+）发现GSK-3β乙酰化水平升高。2、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化增强其酶活性并抑制其泛素化和降解构建GSK-3βK15Q质粒模拟GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化,发现GSK-3βK15Q显着增强其蛋白激酶活性,并显着降低了GSK-3β蛋白的降解,且GSK-3β自身泛素化水平显着降低。3、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化导致小鼠认知能力损伤以及情绪障碍在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3β赖氨酸15位点模拟乙酰化点突变GSK-3βK15Q腺相关病毒,发现GSK-3βK15Q可以导致小鼠的认知功能损伤和情绪障碍。4、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化导致小鼠突触可塑性损伤在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3βK15Q腺相关病毒,发现GSK-3βK15Q导致小鼠突触相关蛋白的表达下降。5、GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化促进Tau的过度磷酸化及胶质细胞的激活在C57小鼠海马CA1区注射GSK-3βK15Q腺相关病毒,发现GSK-3βK15Q促进了小鼠海马区Tau的过度磷酸化,并显着激活了小胶质细胞和星形胶质细胞。6、Tau促进GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化,增加GSK-3β蛋白水平和酶活性AD转基因小鼠和细胞结果表明Tau增加了GSK-3β赖氨酸15位点乙酰化,并导致了GSK-3β的蛋白水平和酶活性增加。7、Tau的乙酰转移酶区域介导了其对GSK-3β的蛋白水平,乙酰化水平的升高及泛素化水平降低。构建消除乙酰转移酶活性的Tau-K18（-）质粒,结果显示:Tau的乙酰转移酶区域介导了其对GSK-3β的蛋白水平,乙酰化水平的升高及泛素化水平降低。8、Tau蛋白可以直接乙酰化GSK-3β构建Tau,Tau-K18（-）及GSK-3β的纯化蛋白,体外乙酰化的实验证明Tau可以直接乙酰化GSK-3β,Tau-K18（-）废除其对GSK-3β的乙酰化。结论:GSK-3β乙酰化可以增加其酶活性并促进AD样病变,Tau蛋白可以乙酰化GSK-3β,GSK-3β的乙酰化会竞争性抑制其泛素化从而抑制其蛋白降解且增强其酶活性。背景:在痴呆症发作前建立大脑储备可能是预防阿尔茨海默病（AD）的一个有前途的策略,而如何启动早期认知刺激尚不清楚。考虑到不成熟的大脑对环境刺激更敏感,而且随着年龄的增长,大脑的活力会下降,我们推断早在胎儿时期就开始对AD进行认知刺激是有效的。目的:探讨孕期丰富环境是否可以预防子代的阿尔兹海默症及其潜在的机制方法:在受孕后,将母代的AD转基因小鼠（3x Tg AD）进行孕期丰富环境（gestational environment enrichment,GEE）直到生产。子代小鼠放置于标准环境中并生长至7月龄大,通过莫里斯水迷宫（Morris water maze）和场景恐惧实验（context fear-conditioning test）来评估7月龄子代小鼠的认知能力。采用蛋白免疫印迹,免疫组织化学,实时荧光定量PCR,染色质免疫共沉淀（CHIP）,电生理记录,高尔基染色,活性实验以及夹心酶联免疫分析等方法来深入了解GEE对胚胎及7-10月龄成年后代有益作用的机制。结果:我们发现GEE显着地保留了7-10月龄的AD模型鼠的突触可塑性和记忆容量,同时伴随着AD的标志性病理的改善。GEE的有益作用伴随着总的组蛋白的高乙酰化,包括BDNF启动子结合区域的组蛋白高乙酰化,在胚胎和子代海马中都具有强健的BDNF m RNA和蛋白表达。GEE使胰岛素样生长因子1（IGF1）表达增加并激活其受体（IGF1R）从而磷酸化Ca2+/钙调素依赖性激酶IV（Ca MKIV）的酪氨酸位点,并触发其核易位,最终导致组蛋白乙酰转移酶（HAT）和BDNF转录的上调。IGF1的上调模拟了GEE的作用,而妊娠期抑制IGF1R或HAT则消除了GEE诱导的Ca MKIV依赖性的组蛋白高乙酰化和BDNF的上调。结论:通过孕期丰富环境可以激活IGF1R/Ca MKIV/HAT/BDNF信号可能是延缓AD进展的一种有前途的策略。
程少泽[2]（2018）在《调控鸡生殖干细胞分化的lncRNA筛选及PGClnc1功能机制研究》文中指出生殖干细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务,通过精卵结合产生新的个体。对于具有这些特殊性质的生殖干细胞,科学家们早在十年前就致力于体外培养和诱导分化成精子和卵子的研究,试图使得精子和卵子能源源不断地通过体外分化产生,这一研究一旦取得成功,将对了解生殖细胞的发生、调控机理、遗传修饰以及临床治疗不育疾病产生深远意义的影响。多年以来,对于其发生机制的研究从未停止过,其主要涉及到关键基因、生长因子等因素的调控,而随着研究的深入,lncRNA在细胞分化中发挥的重要作用逐渐被人发现。lncRNA作为一度被忽视的角色,越来越多的研究发现,其在生物学过程中发挥着不可替代的作用。由于lncRNA在表观遗传、转录水平参与调控许多生理过程中的作用,已得到较为深刻的认知,但对生殖细胞分化的调控研究相对较少。本研究通过单细胞的高通量测序方法检测了鸡胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）、原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）、精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）、成纤维细胞（CEFs）四种细胞的lncRNA表达模式,通过对结果的比较分析,发现胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化这一个复杂的过程中有众多的lncRNA参与其中。而PGCs作为生殖细胞的祖细胞,对其调控的研究具有重要的意义。多年以来,对于PGCs发生机制的研究一直是人们关注的热点,其中主要集中在一些内源性调控因素以及外源性活性物质,而lncRNA在PGCs的发生过程中所扮演怎样的角色,还少有报道,本研究筛选出其中在PGCs中特异高表达的lncRNA,TCONS00948124,在 ESCs 和 SSCs 中低表达,推测该 lncRNA 可能参与了 PGCs的发育调控,将其命名为PGClnc1。为了系统地研究PGClnc1的功能与机制,本研究通过对PGClnc1进行功能性获得和缺失,旨在探索其在PGCs形成过程中的功能及其参与转录水平的调控因素;利用RNA-Pull Down,质谱分析等技术探究与其互作的蛋白及其调节方式,以及探究PGClnc1与cis预测的靶基因BTRC,两者与miRNA之间的ceRNA竞争机制:为阐明PGClnc1在PGCs形成过程中的分子调控机制提供基础依据。研究结果如下:（1）ESCs向PGCs和SSCs分化过程的lncRNA单细胞测序分析收集鸡的ESCs、PGCs、SSCs、CEFs细胞,提取RNA,进行RNA-seq,筛选出参与胚胎干细胞（ESCs）向雄性生殖细胞（PGCs、SSCs）分化过程的差异lncRNA,其中8个lncRNA与ESCs对PGC组的表达变化超过10倍,而在ESCs与SSCs组中的4个lncRNA和PGCs与SSCs组的1个相关 lncRNA 表达变化超过 10 倍,包括 STRA8,WDR91,WNT7A,PTPDC1,BARX1等。对DELs进行GO功能注释表明,超过75%的DELs富集于生物过程,包括细胞因子刺激反应、分化;超过15%DELs富集在分子功能,与miRNA、双链DNA结合有关;而超过8%的DELs富集于细胞成分,与细胞膜表面、细胞器子室相关。DELs的KEGG通路富集分析,20个信号通路显着富集于三组中,包括Jak-STAT signaling pathway和细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、叶酸生物合成（Folate biosynthesis）、TGF-beta signaling pathway、Wnt signaling pathway 和 mTOR signaling pathway、内质网蛋白加工（Proteinprocessing in endoplasmic reticulum）、嘌呤代谢（Purine metabolism）、胰岛素信号通路（Insulin signaling pathway）和 Hedgehog signaling pathway等。在这些信号通路中,DELs 主要包括 ENSGALG00000002005、ENSGALG00000005733、ENSGALG00000002403、ENSGALG00000001967、ENSGALG00000003339、ENSGALG00000006431、ENSGALG00000006794 等。荧光定量 PCR 检测结果显示这些lncRNA的表达量与RNA-seq结果相一致。（2）PGClnc1的筛选与鉴定对筛选获得的差异lncRNA进行分析后发现,在ESCsvs PGCs、ESCs vs SSCs 和 PGCs vs SSCs 组分别有 354,654 和 239 个特异 novel lncRNA;且共有367个特异表达lncRANA参与生殖细胞分化,其中包括ENSGALG0000000038,ENSGALG0000015297,ENSGALG0000011415 等;KEGG 通路富集结果表明 XLOC612989（ACVR2A）、XLOC478357（Lef-1）、XLOC225283（MAPK1）等 lncRNA 能够显着的富集于18条参与雄性生殖细胞分化的关键信号通路,如TGF-β,Notch和Jak-STAT等信号通路;其中PGCs特异表达的lncRNA（TCONS00948124）显着富集于TGF-β signaling pathway,命名为PGClnc1;表达谱检测结果表明:PGClnc1在性腺中高表达,且主要表达于细胞质中,扩增PGClnc1的4个开放阅读框（ORF2、ORF3、ORF6、ORF8）,连接带有his标签的原核融合表达载体pET28a（+）载体,经IPTG诱导细菌蛋白进行Western Blot检测,发现PGClnc1的ORF2可诱导表达his标签蛋白,进而确定PGClnc1具有编码小肽的能力。（3）启动子调节PGClnc1差异表达结合NCBI和UCSC数据库,确定PGClnc1转录起始位点上游1500bp左右的序列为PGClncq1启动子并克隆,置换扩增pEGFP--N1载体中的CMV启动子,将重组载体pPGClnc1-EGFP进行体外转染DF-1细胞,绿色荧光能够正常表达,说明克隆的PGClnc1启动子区域具有活性.,通过缺失片段克隆技术,构建PGClnc1启动子不同缺失片段载体PGL3-P1～PGL3-P6,并通过双荧光素酶报告系统检测发现PGClnc1启动子核心区域为-1033～-661bp;PGClnc1启动子核心区域存在STAT1、TCF7L2、Sox2转录因子结合位点,对这些位点进行点突变实验同时构建相应转录因子点突变载体,通过双荧光素报告系统检测发现这些转录因子对启动子的活性都有一定的正向调控作用,其中TCF7L2作用极显着;利用5-Azadc（1Oμmol/L）、TSA（1μmol/L）处理转染PGL3-P1的DF-1细胞,发现DNA甲基化抑制剂5-Azadc以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后,PGClnc1启动子活性由8.36±3.33上升至68.99±2.29、141.7±3.12,表明降低DNA甲基化水平和提高组蛋白乙酰化水平能够提高PGClnc1启动子活性。（4）PGClnc1在PGCs形成过程中的功能针对PGClnc1序列设计3个shRNA靶位点,构建慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包裹,以qRT-PCR检测慢病毒干扰载体的干扰效率。成功构建干扰载体PGClnc1-sh1、PGClnc1-sh2和PGClnc1-sh3,干扰效率分别为29%±0.04、77%±0.02和47%±0.05（P<0.01）,通过体内和体外两个水平研究PGClnc1在PGCs形成过程中的功能,结果显示:体外实验过程中,在过表达组诱导4天后能出现生殖样细胞,且生殖标记基因有显着性的上调表达,敲除组在相同的情况下则不能。流式细胞分选结果表明,在第4d,正常诱导分化的细胞中类PGCs样细胞所占比例为4.5%±0.19,而在过表达PGClnc1后,比例上升至5.9%±0.21（P<0.01）,相对地,敲低PGClnc1后,比例显着下降至1.1%±0.2（P<0.01）。荧光定量实验结果也显示PGClnc1敲低后PGCs的标记基因cvh的表达（0.3412±0.03）与正常组（1.02454±0.03）相比出现了显着的下调（P<0.01）;间接免疫荧光结果显示,相对于RA诱导组,过表达PGClnc1后CVH蛋白表达增加,而在敲低PGClnc1后,CVH蛋白表达却显着下降;体内实验过程中,鸡胚注射慢病毒载体10μL 106TU/mL+90μLDMEM,注射后能够稳定表达EGFP且鸡胚能够激发绿色荧光。qRT-PCR结果显示在敲低PGClnc1后,cvh、c-kit生殖相关基因大幅度下降到0.245±0.199、0.17±0.0458,过表达PGClnc1,体内各个基因的表达量发生了相反的变化,其中 cvh、c-kit大幅上升至 0.67±0.02、0.85±0.01（P<0.05）;PAS 结果显示敲低 PGClnc1能够显着降低PGCs的产生。流式细胞分选结果显示,在control组中cvh阳性细胞率所占比例为4.2%±0.21,而在过表达PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例上升至5.8%±0.15（P<0.01）,相对地,敲低PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例下降至1%±0.19（P<0.01）。（5）PGClnc1调节PGCs形成过程的分子调控机制探究对PGClnc1的序列进行RNA-pull down和质谱分析,成功获取23个与PGClnc1互作的蛋白,其中包括GAPDH,KRT5,KRT19,LOC776816等已知蛋白以及其他未知蛋白;GAPDH参与调控TGF-β信号通路的信号转导,与本实验室前期对TGF-β信号通路对生殖细胞分化影响的结果相结合,并且对PGClnc1进行干扰或过表达后,发现Smad3基因呈现显着地反向变化趋势,两者存在一种负向调控关系（分别上升至3.52±0.089和下降至0.50±0.026）,Smad3蛋白表达变化趋势与mRNA水平一致,同时结合RIP实验发现,干扰PGClnc1后会在磷酸化水平上对GAPDH的蛋白表达造成影响,进而从蛋白水平上行使功能;然后针对性地对PGClnc1与miRNA的竞争结合机制进行探究,发现PGClnc1和其cis预测的靶基因BTRC具有结合靶点的miRNA是gga-mir-6557-5p,将miRNA的模拟物与抑制物,与PGClnc1的干扰过表达载体共转染DF-1细胞发现,干扰PGClnc1,靶基因表达下调至0.257±0.020;过表达miR,BTRC表达下调至0.566±0.019。干扰BTRC,PGClnc1表达下调至0.788±0.031;过表达miR,PGClnc1表达下调至0.574±0.025,而过表达PGClnc1,过表达miR,BTRC表达上调至 1.257±0.028。
黄晨阳[3]（2017）在《反复种植失败患者子宫内膜KLF12异常高表达抑制胚胎种植的机制研究》文中研究表明目的:研究Kruppel样转录因子家族成员KLF12调控胚胎黏附及间质细胞蜕膜化的分子机制。方法:通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Westerm Blot联合免疫组化方法分析KLF12、白血病抑制因子（LIF）及孤儿核受体NR4A家族成员Nur77在正常可孕妇女增殖期及分泌期内膜表达差异,并同时检测体外雌孕激素联合刺激后KLF12、LIF及Nur77表达变化。进一步检测KLF12、LIF及Nur77于反复种植失败（RIF）患者子宫内膜表达情况。分别通过qRT-PCR及Western Blot方法检测腺病毒介导的上皮细胞（Ishikawa细胞）及人子宫内膜间质细胞（hESC）KLF12高表达分别对LIF及Nur77的表达影响;荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀PCR（ChIP/PCR）及链亲合素-生物素偶联DNA沉淀反应（ABCD）共同证实KLF12直接结合于LIF及Nur77启动子区保守序列并影响其转录活性。在此基础上进一步通过体外胚胎-上皮细胞黏附模型明确KLF12通过调控LIF表达影响胚胎黏附;通过酶联免疫荧光测定法（ELFA）、细胞免疫荧光及体外胚胎-间质细胞种植模型明确KLF12通过调控Nur77表达影响hESCs蜕膜化进程。最终通过Loxp-Cre系统构建Klf12子宫特异性敲入小鼠在体验证KLF12对LIF及Nur77表达的调控作用。结果:月经周期中增殖期内膜KLF12表达较高,而LIF及Nur77表达则于分泌期显着增高,且雌孕激素联合刺激Ishikawa细胞及hESCs后KLF12表达于48 h明显降低而LIF及Nur77表达均于早期显着升高;RIF患者（n=22）子宫内膜KLF12表达较正常可孕妇女（n=18）内膜显着增高,同时LIF及Nur77表达明显减少,且均与KLF12表达呈中度负相关。Ishikawa细胞中KLF12高表达可以抑制LIF表达,并且显着抑制BeWo细胞球黏附率及小鼠囊胚黏附稳定性;hESCs高表达KLF12可以抑制Nur77表达使得hESCs蜕膜化泌乳素（dPRL）分泌减少、细胞骨架蜕膜样变受限及BeWo细胞球扩张/小鼠囊胚孵化受抑。进一步探索机制发现,KLF12可以分别通过结合LIF及Nur77启动子区保守序列（CAGTGGG）抑制此二者转录活性。在体动物实验成功构建Klf12子宫特异性敲入小鼠Klf12loxP/loxPPgrcre/+（Klf12d/d）并验证其子宫组织KLF12高表达,进一步Westem Blot检测证实KLF12子宫特异性高表达后相应Nur77、LIF及其下游分子表达显着降低。结论:月经周期中子宫内膜KLF12表达于分泌期显着降低而LIF及Nur77明显增高,并且雌孕激素联合诱导后KLF12表达下降,提示KLF12为胚胎种植负调控因子;RIF患者内膜上皮组分中异常高表达的KLF12通过转录抑制LIF的表达抑制胚胎黏附;而间质组分中异常增高的KLF12通过转录抑制Nur77表达显着抑制间质细胞蜕膜化,影响胚胎侵入过程,最终导致胚胎种植失败。同时Klf12子宫特异性敲入小鼠存在与体外实验一致的LIF及Nur77表达变化。KLF12调控胚胎种植机制的研究,能够为提高体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中胚胎种植成功率提供坚实的理论基础。
赵欣[4]（2016）在《胰岛素样生长因子2在肿瘤干细胞中的印记丢失及机制研究》文中研究说明肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）的发现是肿瘤研究的里程碑,CSCs在肿瘤的靶向治疗中具有潜在的应用前景。肿瘤细胞中既包含CSCs,也包含非干性肿瘤细胞（non-Stem Cancer Cells,n SCCs）,CSCs是存在于肿瘤细胞中的一小群具有异质性的细胞。通常情况下CSCs在肿瘤细胞中所占比例不足1%,但却决定着肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及耐药。目前已经在多种恶性肿瘤中分离出CSCs,常规的肿瘤治疗手段通常可以杀灭绝大部分的肿瘤细胞,但是难以杀灭CSCs,从而成为肿瘤的复发和转移的根源。因此肿瘤根治的关键是清除CSCs,因此探讨针对CSCs的靶向治疗手段成为目前研究的重点和热点。生长激素/胰岛素样生长因子轴在调控CSCs自我更新能力中扮演着重要角色,研究已发现在多种肿瘤中存在IGF通路的激活。通过刺激PI3K和MAPK级联途径,IGF1和IGF2促进细胞增殖并诱导肿瘤细胞对放化疗及靶向治疗的抵抗。在大多数正常组织中IGF2是母源印记的,仅表达父源等位基因。但是在许多肿瘤中存在这种印记表达的丢失,从而导致了IGF2基因的双等位表达。研究表明这种异常高表达的IGF2加强了CSCs的自我更新,并促进肿瘤细胞的增殖,IGF2印记丢失与肿瘤的起源密切相关。目前关于IGF2印记丢失在CSCs“干性”维持及自我更新中的作用研究较少。目的:（1）分析IGF2在CSCs中的印记丢失情况,并比较CSCs和n SCCs的印记表达差异;（2）研究IGF2印记丢失在维持CSCs干性、自我更新能力及放化疗抵抗中发挥的作用;（3）探究CSCs中IGF2印记丢失的表观调控机制。方法:（1）利用流式细胞分选技术通过CD133抗体标记从实体肿瘤细胞分离出CSCs;（2）采用无血清悬浮培养法富集CSCs用于下一步印记分析等实验;（3）通过成球实验、免疫荧光染色和流式细胞术CSC标志蛋白表达测定等实验鉴定CSCs;（4）通过测序法研究IGF2在CSCs中的印记表达情况;（5）应用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表达;应用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表达;（6）通过软琼脂克隆形成实验检测CSCs的克隆形成能力;（7）采用WST-1细胞增殖实验评估CSCs对放化疗敏感性;（8）利用染色质构象捕获技术（3C）研究CSCs染色质内部空间结构;（9）利用染色质免疫共沉淀技术（Ch IP）研究IGF2的印记表达与H3K27甲基化的相关性;（10）应用小RNA干扰的方法建立IGF2瞬时干涉细胞模型,通过细胞增殖实验、细胞周期及凋亡测定、细胞迁移及侵袭试验等,研究IGF2在维持CSCs特性中发挥的作用。结果:（1）利用流式细胞分选技术通过CD133抗体标记从6种实体肿瘤细胞分离出CSCs和Non-CSCs。CSCs可在干细胞培养基中成球培养,连续消化传代后仍保持与原代相同的形态特征;（2）应用免疫荧光技术发现CSC标志物CD133和乙醛脱氢酶（ALDH）在6种CSCs表面持续阳性表达;（3）采用流式细胞仪对分选前后的肿瘤细胞进行CD133+表达的检测,结果显示超过90%的成球细胞为CD133阳性;（4）通过测序法测定IGF2在CSCs中的印记表达情况,结果显示CSCs中存在IGF2印记丢失。即使来源于IGF2印记保持细胞株的CSCs也存在IGF2印记丢失现象;（5）应用q RT-PCR法研究CSCs中IGF2在基因水平上的表达,结果显示与non-CSCs相比IGF2在CSCs中的表达明显升高;应用Western blotting方法研究CSCs中IGF2在蛋白水平上的表达,结果显示与non-CSCs相比,IGF2在CSCs中的表达明显升高;（6）应用软琼脂克隆形成实验检测CSCs的克隆形成能力,结果显示CSCs中IGF2的表达上调导致肿瘤克隆形成能力增强;（7）采用WST-1细胞增殖实验评估CSCs对放化疗的敏感性,结果发现与non-CSCs相比,IGF2高表达的CSCs对5-FU和奥沙利铂的耐药性增强,对放疗的抵抗能力增强;（8）利用染色质构象捕获技术（3C）检测CSCs染色质内部空间结构,结果显示CSCs中的染色质内连接产物信号强度明显降低;（9）利用染色质免疫共沉淀技术（Ch IP）检测了IGF2启动子上H3K27甲基化水平,结果发现CSCs中IGF2启动子H3K27甲基化水平明显降低,导致对IGF2启动子的抑制作用降低;（10）应用小RNA干扰的方法建立IGF2瞬时干涉细胞模型,研究IGF2在维持CSCs特性中发挥的作用。结果显示:干涉IGF2基因后,CSCs中CD133+的比例明显降低,细胞增殖受到明显抑制,细胞周期发生改变（G2/M期细胞增多,G0/G1减少）,凋亡增加,迁移和侵袭能力下降,对放化疗的敏感性增强。结论:（1）CSCs中存在IGF2印记丢失,IGF2印记丢失可能是CSCs的标志性特征之一;（2）CSCs中IGF2印记丢失在维持CSCs特性中发挥重要作用,并促进了CSCs的自我更新及放化疗抵抗;（3）CSCs中IGF2印记丢失与染色质内环结构消失及组蛋白H3K27甲基化这一基因表观遗传修饰相关。
汤绍辉,张少华,张小娟,吴胜兰,李俊峰,江向武,周鸿科,罗羽宏,曹明溶[5]（2014）在《乙型肝炎病毒X蛋白通过诱导P3启动子低甲基化促进胰岛素样生长因子-Ⅱ基因表达》文中研究表明目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）基因P3启动子驱动的mRNA表达的影响及其表观遗传机制。方法分别采用定量RT-PCR和亚硫酸氢盐测序法检测HBV感染阳性和阴性肝癌组织中P3 mRNA、HBx mRNA表达水平及P3启动子甲基化状态;进一步分析稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx及其对照细胞株HepG2-control中P3 mRNA表达水平及P3启动子甲基化状态;最后,将体外甲基化的IGF-Ⅱ基因P3启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P3及携带HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶试验检测HBx蛋白对P3启动子转录活性和甲基化状态的影响。计数资料采用x2或Fisher精确检验,计量资料采用独立样本t检验或Mann--Whitney U检验,线性相关分析采用Pearson相关系数评价。结果（1）HBV感染阳性的肝癌组织中P3 mRNA表达水平（△CT为-9.59士3.22）明显高于HBV阴性的肝癌组织（△CT为-12.97±3.08）,P=0.006;而P3启动子17个CpG位点的平均甲基化水平（36.9%±15.5%）明显低于HBV阴性的肝癌组织（52.1%±19.1%）,P=0.025;P3 mRNA丰度与HBx mRNA表达水平呈正相关,而与P3启动子甲基化水平呈负相关。（2）在HepG2-HBx及其对照细胞中,也显示了类似的P3 mRNA表达水平及P3启动子甲基化水平变化。（3）体外转染的HBx蛋白显着降低了P3启动子甲基化水平,提高了其转录活性。结论 HBx蛋白可能通过降低P3启动子甲基化水平促进肝细胞癌IGF-Ⅱ基因表达,本结果为充分理解HBx蛋白介导的肝细胞癌发病机制提供了新的信息。
周鸿科,杨冬华,汤绍辉,黄卫[6]（2011）在《人胰岛素样生长因子ⅡP4启动子调控胸苷激酶载体的构建》文中进行了进一步梳理目的探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ（IGFⅡ）P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）/丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应。方法用分子生物学方法构建IGF-ⅡP4启动子和巨细胞病毒启动子（CMV）调控下HSV-tk与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒,并用脂质体转染法将其转入肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中,在荧光显微镜下观察荧光表达情况。加入GCV使总浓度分别为0、1.0、10.0和100.0μg/ml,用四甲基偶氮唑盐实验检测HSV-tk/GCV系统对各种细胞的杀伤作用,用RT-PCR法检测转染前后胸苷激酶（tk）和EGFP mRNA的表达情况。用方差分析进行统计学处理。结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;pDC316-tkEGFP-CMV和pDC316-tkEGFP P4转染的HepG2细胞均出现明显的细胞生长抑制现象,两者转染细胞的抑制率分别为6.95%±0.67%、24.99%±1.53%、49.68%±1.68%和71.85%±3.28%,4.83%±0.35%、17.34%±1.15%、30.17%±1.30%和40.39%±0.82%,转染后者对HepG2细胞的抑制率低（F=24.055,P<0.05）,pDC316 tkEGFP-CMV转染的HeLa细胞也出现明显的细胞生长抑制现象,其抑制率分别是6.36%±0.83%、23.95%±1.72%、45.13%±1.64%和69.38%±3.17%,转染质粒pDC316 tkEGFP-P4的HeLa细胞未发现明显的细胞抑制现象。结论成功构建IGF-ⅡP4启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础。
梁伟[7]（2011）在《小鼠KGF毛囊特异性表达载体构建及转基因ESC的筛选与鉴定》文中提出角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）属于成纤维细胞生长因子家族,也叫FGF-7,它仅特异地刺激角质细胞和其他上皮细胞的增殖。研究发现KGF在生长期的毛乳头细胞表达,它与毛囊中的KGF受体特异性结合后可刺激皮肤毛囊的生长,这说明KGF具有支持毛囊生长的作用。毛囊特异性表达载体的构建和转基因动物模型作为研究基因功能的重要手段,可以用来探究该基因在小鼠毛囊发育过程中的作用和调控机制。为了阐明KGF在小鼠毛囊发育过程中的功能,本研究利用转基因技术,用脂质体转染法将毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA导入到小鼠胚胎干细胞中,经G418筛选获得稳定表达KGF基因和红色荧光蛋白的转基因ES细胞。为建立KGF过表达的转基因小鼠提供核供体,从而为通过构建转基因小鼠模型来研究KGF基因对小鼠毛囊的作用提供研究基础。1.毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA的构建利用RT-PCR技术从小鼠成纤维细胞总RNA中扩增小鼠角质细胞生长因子（KGF）编码区cDNA序列,以pBlue-T克隆载体为骨架构建中间载体pB-KGF。将UHS启动子和BGH polyA尾片段分别连接在pB-KGF载体的SacⅠ+XbaⅠ和EcoR V +Sal I位点,再将UHS+KGF+polyA基因片段连接在pCDsRed2表达载体的SacⅠ+SalⅠ位点,构建成毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA （6.6 kb）。经酶切和DNA测序验证,本研究所构建的表达载体pCDsR-UKA结构与序列均与预期设计相符合。2.小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养与饲养层的制作通过单细胞接种法成功分离出13.5d的小鼠原代胚胎成纤维细胞,利用高糖DMEM+10%FBS培养液在37℃、5%CO2、100%湿度条件下体外培养和传代。P1-P3代小鼠胚胎成纤维细胞用20μg/mL丝裂霉素C处理后制作饲养层,将ES细胞传代在饲养层上,利用80%高糖DMEM+15%FBS+LIF胚胎干细胞培养液在37℃培养箱进行培养。同时绘制了小鼠第2代MEF和SNL细胞的生长曲线,并对ESC进行AKP染色、Oct-4和SSEA-1免疫荧光染色,以及制作并分析了ES细胞中期染色体核型。通过以上实验证明,培养的小鼠ES细胞在体外培养环境下克隆生长状态正常且并未分化,可以用于外源基因脂质体转染效率的研究。3.小鼠ES细胞的外源基因转染条件优化以及转基因ES细胞的筛选和鉴定本实验进行了G418对小鼠ES细胞的耐受性测定,浓度稀释梯度实验结果确定G418的最佳筛选浓度为800μg/mL,维持浓度为400μg/mL。用脂质体2000转染小鼠胚胎干细胞,分别对转染时的DNA浓度、脂质体剂量、转染孵育时间等条件进行了梯度优化,48h后统计不同组别的转染效率,得出最佳的转染条件。实验结果发现利用优化的脂质体转染悬浮ES细胞的条件,在6孔板中当DNA与脂质体比例为3：10时,可获得最高转染效率（34.4±4.1）%。对转染48小时后的ES细胞以800μg/mL G418为抗性筛选浓度,在胚胎干细胞培养液中于37℃培养箱里连续筛选培养4-5天,后换为400μg/mL G418维持筛选5-6天,获得了稳定表达红色荧光蛋白的转基因ES细胞克隆。通过对转基因ES细胞基因组DNA的PCR扩增检测,证实KGF基因已稳定整合在转基因ES细胞基因组中。同时对转基因ES细胞进行了染色体核型分析,碱性磷酸酶染色、Oct-4和SSEA-1免疫荧光染色,证明了转基因ES细胞在体外生长状态正常且并未分化,可以为四倍体囊胚提供供体ES细胞,制备ES小鼠模型,为进一步研究KGF对小鼠毛囊的促进和调控作用奠定了基础。
黄伟,邓亮生,高钟镐,王玉丽,宋影文,郭凯琪,陈晓旋,冯来武[8]（2010）在《人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响》文中研究表明目的探讨人胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响。方法收集131名健康中国人的血液样品,提取基因组DNA并进行基因扫描分析,测定人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性并计算其频率分布。通过PCR方法扩增含有不同长度CA微卫星的P1启动子单体型片段,插入至缺少启动子的pGL4.10质粒载体上的荧光素酶报告基因的上游。通过双荧光素酶报告基因分析法测定含不同长度CA微卫星的P1启动子单体型的活力,比较CA微卫星多态性对P1启动子活性的影响。结果共发现9种CA微卫星多态性,分别为13CA、16CA、17CA、18CA、19CA、20CA、21CA、22CA和23CA,其中分布频率大于5%的有17CA、18CA、19CA、20CA和21CA多态性,分布频率最高的为19CA多态性。双荧光素酶报告基因分析结果表明,P1启动子单体型之间存在活力差异,其中16CA启动子单体型的活力最高,21CA启动子单体型的活力最低。结论人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性能够影响P1启动子的活性。
汤绍辉,曲春晖,杨敏英,罗羽宏,杨冬华[9]（2010）在《HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响》文中提出目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:（1）经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。（2）获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。（3）转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP（P<0.01）。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。
李懿[10]（2009）在《11p15.5染色体区相关印记基因IGF-2和TSSC3在骨肉瘤中的表达及调控机制研究》文中研究说明骨肉瘤（osteosarcoma）是好发于青少年的高侵袭性的骨原发性恶性肿瘤,早期即可发生广泛的肺转移,死亡率高。目前的观点认为,骨肉瘤的发生是一个多阶段演进和多基因参与的过程,但确切的发病机制尚未阐明。既往对骨肉瘤的研究主要集中于遗传学层面,发现TP53、RB、p16INK4、p14ARF和MDM等多个基因的扩增、重组和点突变与骨肉瘤密切相关。但随着肿瘤病因学研究的逐步深入,人们认识到肿瘤不仅仅是一种遗传性疾病,同时也是一种表遗传性疾病,几乎所有人类肿瘤中都有表观遗传的异常。其中基因印记,作为一种表遗传学机制,在肿瘤演进中发挥重要作用。基因印记是一种不遵循孟德尔定律的遗传现象,使不同亲本起源的等位基因具有不同的表达特性,呈单等位基因表达,具有这种现象的基因称为印记基因。研究发现,印记基因具有原癌基因或抑癌基因功能,其相当于功能上的单倍体,仅需一次打击就可引起以原癌基因或抑癌基因身份发挥作用的印记基因功能异常,从而增加了肿瘤发生的易感性。目前认为,DNA甲基化是基因印记形成和维持的分子基础,亲本等位基因特异性的失活就是由启动子区CpG岛（印记控制区）的甲基化作用实现的。DNA甲基化模式的异常,使印记基因功能紊乱,一方面,全基因组广泛的低甲基化引起原癌基因活化,使基因组不稳定性增加;另一方面,启动子的高甲基化可使抑癌基因失活,促进细胞的恶性转化。与基因突变不同,肿瘤发生过程中甲基化模式的异常具有可逆性,以逆转基因甲基化突变为代表的表遗传学策略,为肿瘤的治疗提供了新的思路。印记基因及甲基化修饰在肿瘤发生中的作用引起了学者们的广泛关注,研究发现父本印记的等位基因抑制生长,而母本印记的等位基因刺激生长,印记基因的表达具有时空和组织的特异性,在不同的肿瘤中具有不同的印记异常模式和甲基化表型。为了明确骨肉瘤特异性的印记基因作用模式,在前期的研究中,我们运用致癌剂MNNG和促癌剂TPA联合处理人胚永生化成骨细胞hFOB1.19,建立了成骨细胞恶性转化模型,模拟骨肉瘤的演进;通过高密度寡核苷酸芯片筛选得到骨肉瘤特异的印记基因表达谱,结果发现,10个差异表达的印记基因参与了成骨细胞的恶性转化,其中有5个位于人11p15.5染色体区,我们推测11p15.5染色体区与骨肉瘤发生密切相关。为了明确位于11p15区的这些差异表达的印记基因在骨肉瘤中的作用及调控机制,本研究选择母本印记的IGF-2基因和父本印记的TSSC3基因进一步深入研究。IGF-2基因,编码一种丝裂原蛋白肽,参与胚胎发育、细胞分化等多种生理过程。人IGF-2基因包含4个不同的启动子（P1-P4）,呈发育阶段和组织特异性的表达。在人类上皮性肿瘤和某些肉瘤中,IGF-2基因过度表达,胚胎源性的P3和P4启动子活性上调,与印记丢失、差异甲基化区域和启动子区域的低甲基化相关。在骨肉瘤中也有IGF-2基因高表达与P3和P4启动子特异转录本表达上调相关的报道,但谁是骨肉瘤发生中的优势启动子,其表达调控的机制如何,目前尚不清楚。TSSC3基因,又名IPL基因,是第一个被报道的凋亡相关印记基因,位于11p15抑癌基因区,推测其有抑制生长的效应。目前仅在Wilms’肿瘤、完全性葡萄胎和恶性胶质瘤中有表达缺失的报道,但在骨肉瘤中TSSC3基因的表达如何,参与印记形成的DNA甲基化机制是否与其表达相关,目前尚缺乏相关研究。为此,本实验分两部分进行:第一部分拟通过免疫组化、RT-PCR技术检测骨肉瘤中IGF-2基因及其相关启动子特异转录本的表达,以明确骨肉瘤中IGF-2基因的优势启动子,并采用RFLP和BSP方法检测IGF-2基因的印记状态和相关区域的甲基化表型,目的在于阐明骨肉瘤特异的IGF-2转录本相关的调控机制。第二部分拟采用RT-PCR方法检测骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞株中TSSC3基因的表达,并用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理骨肉瘤细胞,检测其对骨肉瘤细胞生物学活性的影响,分析TSSC3基因表达与启动子甲基化表型的相关性,接着对TSSC3基因的功能进行初步研究,目的在于阐明骨肉瘤中TSSC3基因的表达调控机制及可能的抑癌基因作用,为骨肉瘤的表遗传学治疗提供理论基础。主要的结果如下:1.免疫组化方法检测显示:骨肉瘤组织中IGF-2蛋白表达的阳性率为83.3% （20/24）,IGF-2蛋白的表达在骨肉瘤病理组织学分型、性别和年龄中的差异无明显统计学意义（P>0.05）。2.RT-PCR方法检测显示:20例IGF-2阳性的骨肉瘤标本中,IGF-2基因成人源性的P1启动子表达丰度为0.12±0.03,胚胎源性的P3启动子表达丰度为1.86±0.15,P4启动子的表达丰度为1.43±0.15,与胚胎肝组织中P3、P4启动子的表达一致,同时P4转录本扩增34个循环的表达丰度近似于P3转录本扩增30个循环的表达丰度,提示P3启动子的活性最高,是骨肉瘤中IGF-2基因表达的优势启动子,在非肿瘤组织中P3启动子活性亦增高,表达丰度为1.53±0.11。3.RFLP方法检测显示:20例骨肉瘤组织中有3例标本IGF-2基因印记丢失,而配对的非肿瘤组织中仅有1例印记丢失。4.BSP方法检测显示:20例骨肉瘤组织中,DMR区域CG位点的平均甲基化率在IGF-2 P3阳性标本与P3阴性标本中分别为52%±3%和43%±2%,两者之间的差异无明显统计学意义（P>0.05）;而配对的非肿瘤组织中,DMR区域CG位点的平均甲基化率在IGF-2 P3阳性标本与P3阴性标本中分别为44%±2%和51%±3%,两者之间的差异无明显统计学意义（P>0.05）;肿瘤和非肿瘤组织中DMR区CG位点的平均甲基化率与IGF-2 P3表达的相关性无明显统计学意义（P>0.05）。5.BSP方法检测显示:20例骨肉瘤组织中,IGF-2 P3启动子区域CG位点的平均甲基化率在P3阳性标本与P3阴性标本中分别为29%±2%和75%±4%,两者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）;而配对的非肿瘤组织中,IGF-2 P3启动子区域CG位点的平均甲基化率在P3阳性标本与P3阴性标本中分别为35%±3%和72%±4%,两者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）;肿瘤和非肿瘤组织中P3启动子区CG位点的平均甲基化率与IGF-2 P3表达的相关性具有统计学意义（R=0.357, P<0.05）。6.RT-PCR方法检测显示:骨肉瘤SaOS2细胞中TSSC3表达缺失,骨肉瘤组织中TSSC3表达缺失率为54.2%（13/24）,表达丰度为0.18±0.03,较配对的非肿瘤组织低,两者之间差异具有统计学意义（P<0.05）,且TSSC3基因表达缺失与IGF-2基因过度表达的相关性具有非常显着的统计学意义（R=0.665, P=0.01）,但TSSC3基因的表达缺失在骨肉瘤病理组织学分型、性别和年龄中的差异无明显统计学意义（P>0.05）。7.BSP方法检测显示:SaOS2细胞中TSSC3基因启动子区CG位点的平均甲基化率为91%±4%,而去甲基化制剂5-Aza-CdR处理后TSSC3基因启动子区的平均甲基化率为57%±3%,较处理前明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。8.MTT实验、RT-PCR、Western Blot、F-actin染色和流式细胞仪检测显示:5-Aza-CdR能抑制SaOS2细胞生长,呈明显的剂量依赖性作用,IC20浓度为7.5μM;不同浓度的5-Aza-CdR处理SaOS2细胞后TSSC3 mRNA和蛋白重新表达,其中以IC20浓度组增高最明显,表达丰度分别为0.78±0.04和0.59±0.05;处理组细胞的肌动蛋白丝较未处理组缩短并减少,伸展性差;IC20和5IC20处理组细胞的凋亡率分别为5.94%和13.97%,较未处理组细胞（0.51%）增高明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。9.采用基因克隆技术成功构建了TSSC3表达载体pEGFP-C3-TSSC3,以脂质体方法转染SaOS2细胞后,用RT-PCR和Western Blot方法检测TSSC3基因的表达,结果显示:转染的SaOS2细胞能重组表达TSSC3基因的mRNA和蛋白。10.MTT实验、流式细胞仪和Real-time PCR方法检测显示:pEGFP-C3-TSSC3转染骨肉瘤SaOS2细胞72h后,细胞的生长抑制率为11.9%,呈明显的时间依赖性作用,细胞的凋亡率增高为9.53%,caspase-3 mRNA的表达丰度增高为1.31±0.04,与SaOS2组和pEGFP-C3-SaOS2组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。主要的结论如下:1.印记基因IGF-2表达上调是骨肉瘤中的高发事件。2.骨肉瘤中IGF-2 P3和P4启动子重新活化和表达,其中P3启动子转录活性最高,其高表达可能是IGF-2表达上调的主要机制之一,可能作为骨肉瘤发生中的早期事件参与骨肉瘤的演进。3. IGF-2 P3启动子低甲基化可能是上调IGF-2 P3表达的主要调控机制之一,在骨肉瘤演进中发挥促进作用,可能成为骨肉瘤早期诊断和预后评价的分子靶标。4. TSSC3基因表达缺失可能在骨肉瘤的发生和演进中起重要作用,其与IGF-2基因可能的拮抗作用共同参与骨肉瘤的演进。5. TSSC3基因启动子的高甲基化是该基因表达沉默的重要机制之一,并且TSSC3基因DNA甲基化异常是可逆的,为临床上应用去甲基化药物治疗骨肉瘤提供了理论依据。6. 5-Aza-CdR可能是通过激活TSSC3基因表达而发挥对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用,明确了骨肉瘤表遗传治疗的可行性,为骨肉瘤的治疗策略提供了新的思路。7. SaOS2细胞中TSSC3能发挥抑癌基因作用,其表达缺失使得细胞凋亡减少,细胞增殖紊乱,生长失控,从而促进肿瘤的发生,TSSC3有可能成为骨肉瘤治疗的新靶标。本研究从表遗传学层面探讨了骨肉瘤的发病机制,上述研究结果揭示了骨肉瘤特异的印记基因IGF-2和TSSC3的表达模式和调控机制,为骨肉瘤的早期诊断提供了新的分子靶点,为骨肉瘤的表遗传治疗提供了理论依据。
二、人胰岛素样生长因子Ⅱ基因P1、P3启动子克隆及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人胰岛素样生长因子Ⅱ基因P1、P3启动子克隆及意义（论文提纲范文）
（1）糖原合酶激酶-3β乙酰化以及孕期环境丰富在阿尔兹海默病样神经损伤或保护中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 GSK-3β乙酰化在阿尔兹海默病中的作用及机制 |
| 摘要 1 |
| Abstract 1 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 第二部分 孕期丰富环境通过激活IGF信号通路从而预防阿尔兹海默症 |
| 摘要 2 |
| Abstract 2 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 糖原合成酶激酶-3β在阿尔兹海默病中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读学位期间发表和参与研究工作的文章 |
| 附录二 攻读学位期间参与基金课题研究 |
| 附录三 攻读学位期间获奖及参加国际学术会议情况 |
| 致谢 |
（2）调控鸡生殖干细胞分化的lncRNA筛选及PGClnc1功能机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 lncRNA参与细胞分化调控方式的研究进展 |
| 1.1 通过与microRNA互作参与细胞分化 |
| 1.2 通过招募蛋白形成复合物,发挥支架作用,参与细胞分化 |
| 1.3 通过对转录因子的诱饵作用参与细胞分化 |
| 2 lncRNA在不同物种中调控机制的研究进展 |
| 2.1 lncRNA在果蝇中调控机制的研究进展 |
| 2.2 lncRNA在哺乳动物中调控机制的研究进展 |
| 2.3 lncRNA在禽类调控方式的研究展望 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 4 参考文献 |
| 第二章 ESCs向PGCs和SSCs分化过程的lncRNA测序分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 细胞分离纯化 |
| 1.4.2 细胞扩增 |
| 1.4.3 转录组测序 |
| 1.4.4 RNA-seq数据分析流程 |
| 1.4.5 测序数据的荧光定量PCR验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 样本扩增结果 |
| 2.3 测序数据过滤 |
| 2.4 参考序列的比对分析 |
| 2.5 RNA-seq整体质量评估 |
| 2.6 lncRNA的鉴定与分析 |
| 2.6.1 lncRNA的逐步筛选 |
| 2.6.2 编码潜能筛选 |
| 2.7 差异lncRNA的筛选 |
| 2.7.1 ESCs vs PGCs组 |
| 2.7.2 ESCs vs SSCs组 |
| 2.7.3 PGCs vs SSCs组 |
| 2.8 差异lncRNA表达GO分析 |
| 2.8.1 ESCs vs PGCs组 |
| 2.8.2 ESCs vs SSCs组 |
| 2.8.3 PGCs vs SSCs组 |
| 2.9 差异lncRNA表达KEGG分析 |
| 2.9.1 ESCs vs PGCs组 |
| 2.9.2 ESCs vs SSCs组 |
| 2.9.3 PGCs vs SSCs组 |
| 2.10 荧光定量PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 PGClnc 1特异性筛选以及编码小肽的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 特异表达lncRNA数据分析 |
| 1.2.2 核质分离 |
| 1.2.3 qRT-PCR检测 |
| 1.2.4 PGClnc1开放阅读框(ORF)的预测分析 |
| 1.2.5 鸡PGClnc1原核表达载体pET-28a(+)-PGClnc1的构建与鉴定 |
| 1.2.6 质粒pET-28a(+)-PGClnc1的诱导表达(表达菌株的筛选和目的蛋白的诱导表达) |
| 1.2.7 细菌蛋白的提取 |
| 1.2.8 SDS-PAGE电泳 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选特异表达lncRNA,以及PGClnc1的挖掘 |
| 2.1.1 组间差异lncRNA韦恩分析 |
| 2.1.2 特异表达lncRNA的GO和pathway分析 |
| 2.1.3 PGClnc1的挖掘 |
| 2.2 PGClnc1的组织特异性以及细胞定位 |
| 2.2.1 PGClnc1组织特异性 |
| 2.2.2 PGClnc1的细胞定位 |
| 2.3 编码小肽机制的研究 |
| 2.3.1 PGClnc1的重组表达质粒pET28a(+)的构建 |
| 2.3.2 PGClnc1的原核融合表达载体诱导蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 启动子调节PGClnc1差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料和试剂 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 PGClnc1启动子区域的生物学信息学分析 |
| 1.2.2 鸡胚全基因组的提取 |
| 1.2.3 真核表达载体pPGClnc1-EGFP的构建 |
| 1.2.4 鸡PGClnc1启动子活性定性分析 |
| 1.2.5 鸡PGClnc1核心启动子区域的鉴定 |
| 1.2.6 鸡PGClnc1核心启动子区域调控元件的分析 |
| 1.2.7 鸡PGClnc1基因核心启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 真核表达载体pPGClnc1-EGFP的构建 |
| 2.2 PGClnc1启动子活性定性分析 |
| 2.3 PGClnc1启动子各缺失克隆载体的构建 |
| 2.4 PGClnc1启动子活性分析 |
| 2.5 转录因子调节PGClnc1启动子活性 |
| 2.5.1 PGClnc1启动子核心区域转录因子结合位点预测及点突变 |
| 2.5.2 转录因子调节PGClnc1启动子启动活性 |
| 2.6 PGClnc1启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 PGClnc1调控鸡PGCs生成的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 PGClnc1慢病毒干扰载体构建及慢病毒包裹 |
| 1.2.2 慢病毒干扰载体干扰活性检测 |
| 1.2.3 ESCs的分离培养与鉴定 |
| 1.2.4 体外诱导检测 |
| 1.2.5 体内鸡胚慢病毒注射 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 慢病毒RNA干扰质粒PGClnc1-shRNA和阴性对照质粒的构建 |
| 2.2 慢病毒干扰载体干扰活性检测 |
| 2.3 体外诱导检测 |
| 2.3.1 ESCs形态变化观察 |
| 2.3.2 体外PGCs生成效率检测 |
| 2.4 体内鸡胚慢病毒注射 |
| 2.4.1 慢病毒整合鸡胚基因组检测 |
| 2.4.2 PGCs生成效率检测 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第六章 PGClnc1调节PGCs形成过程中的分子调控机制探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 PGClnc1的RNA获取 |
| 1.2.2 RNA pull-down |
| 1.2.3 蛋白质银染 |
| 1.2.4 RNA pull down获得蛋白鉴定 |
| 1.2.5 互作蛋白GAPDH磷酸化位点预测 |
| 1.2.6 RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 1.2.7 荧光定量PCR检测TGF-β信号通路关键节点基因表达 |
| 1.2.8 SDS-PAGE电泳检测TGF-β信号通路关键节点基因蛋白表达 |
| 1.2.9 生物信息分析与靶基因具有结合靶点的miRNA |
| 1.2.10 结合miRNA测序结果分析得到与PGClnc1具有结合靶点的miRNA |
| 1.2.11 对PGClnc1与靶基因的公共靶点miRNA分析 |
| 1.2.12 miRNA-Inhibitor载体的构建 |
| 1.2.13 miRNA-mim载体的构建 |
| 1.2.14 DF-1细胞的培养 |
| 1.2.15 miRNA-mim、miRNA-Inhibitor分别与PGClnc1与BTRC的过表达、干扰载体共转染DF-1细胞 |
| 1.2.16 qRT-PCR检测miRNA以及PGClnc1和BTRC的表达变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 PGClnc1的sense和antisense链体外模板获得 |
| 2.2 PGClnc1 RNA pull down以及质谱分析 |
| 2.3 磷酸化位点预测 |
| 2.4 结合RIP实验探究PGClnc1与互作蛋白结合方式 |
| 2.5 PGClnc1与互作蛋白相关信号通路调控关系初步验证 |
| 2.6 PGClnc1与BTRC的结合miRNA分析 |
| 2.7 PGClnc1竞争调节机制研究 |
| 2.8 PGClnc1与gga-mir-6577-5p竞争结合机制及互作蛋白调控PGCs形成的作用模式图 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 本文结论与创新 |
| 本文结论 |
| 全文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（3）反复种植失败患者子宫内膜KLF12异常高表达抑制胚胎种植的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 反复种植失败患者子宫内膜组织KLF12表达增高 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 KLF12通过转录抑制LIF表达影响胚胎黏附 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 KLF12通过转录抑制Nur77表达影响人子宫内膜间质细胞蜕膜化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 KLF12子宫特异性敲入小鼠建立并初步探究LIF、Nur77表达变化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 综述 子宫内膜上皮细胞与间质细胞在胚胎种植中的重要作用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:主要仪器 |
| 在校期间发表文章情况及研究成果 |
| 基金资助来源 |
| 致谢 |
（4）胰岛素样生长因子2在肿瘤干细胞中的印记丢失及机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 IGF2基因及表达调控 |
| 1.1.1 IGF家族 |
| 1.1.2 IGF2基因结构 |
| 1.1.3 IGF2基因表达调控 |
| 1.2 IGF2的生理功能 |
| 1.2.1 IGF2参与细胞生长与分化 |
| 1.2.2 IGF2与血管生成密切相关 |
| 1.3 IGF2与疾病 |
| 1.3.1 IGF2与生长障碍 |
| 1.3.2 IGF2与心血管疾病 |
| 1.3.3 IGF2与肿瘤 |
| 1.4 立题依据—IGF2在肿瘤干性细胞中印记丢失及调控的研究意义 |
| 1.5 研究路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂与设备 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要器材 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞 |
| 2.4 主要实验材料和方法 |
| 2.4.1 细胞系及培养 |
| 2.4.2 流式细胞分选法分离CSCs |
| 2.4.3 流式细胞术检测CD133+表达 |
| 2.4.4 肿瘤干细胞成球培养 |
| 2.4.5 免疫荧光分析 |
| 2.4.6 DNA的提取 |
| 2.4.7 总RNA提取 |
| 2.4.8 RNA内残留DNA的处理 |
| 2.4.9 逆转录合成c DNA |
| 2.4.10 IGF2印记表达分析 |
| 2.4.11 染色质构象捕获法 |
| 2.4.12 Real-time PCR |
| 2.4.13 染色质免疫共沉淀实验 |
| 2.4.14 Western印记杂交 |
| 2.4.15 软琼脂克隆形成实验 |
| 2.4.16 化疗敏感性实验 |
| 2.4.17 放疗抵抗实验 |
| 2.4.18 小RNA干扰瞬时干涉实验 |
| 2.4.19 细胞周期检测 |
| 2.4.20 细胞凋亡检测 |
| 2.4.21 侵袭试验 |
| 2.4.22 迁移试验 |
| 2.4.23 统计分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 肿瘤干细胞的分离及特性 |
| 3.1.1 肿瘤干细胞的分离及成球培养 |
| 3.1.2 细胞成球实验 |
| 3.1.3 CSC标志CD133的表达检测 |
| 3.1.4 CSC标志ALDH的表达检测 |
| 3.1.5 分选前后CD133阳性细胞的流式检测 |
| 3.2 肿瘤干细胞IGF2印记丢失 |
| 3.3 染色质构象捕获 |
| 3.4 肿瘤干细胞中IGF2的表达上调 |
| 3.4.1 CSCs中IGF2基因水平表达上调 |
| 3.4.2 CSCs中IGF2蛋白水平表达上调 |
| 3.5 肿瘤干细胞的克隆形成能力增强 |
| 3.6 IGF2表达上调的肿瘤干细胞存在放化疗抵抗 |
| 3.6.1 IGF2表达上调的CSCs存在化疗抵抗 |
| 3.6.2 IGF2表达上调的CSCs存在放疗抵抗 |
| 3.7 IGF2在维持肿瘤干细胞特性中发挥重要作用 |
| 3.7.1 两条针对IGF2干涉序列的干涉效果 |
| 3.7.2 干涉IGF2后对CSCs干细胞标志表达的影响 |
| 3.7.3 干涉IGF2后对CSCs细胞增殖的影响 |
| 3.7.4 干涉IGF2后对CSCs细胞周期的影响 |
| 3.7.5 干涉IGF2后对CSCs细胞凋亡的影响 |
| 3.7.6 干涉IGF2后对CSCs细胞迁移能力的影响 |
| 3.7.7 干涉IGF2后对CSCs细胞侵袭能力的影响 |
| 3.7.8 干涉IGF2后对CSCs细胞化疗敏感性的影响 |
| 3.7.9 干涉IGF2后对CSCs细胞放疗敏感性的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 肿瘤干细胞中存在IGF2印记丢失 |
| 4.2 肿瘤干细胞中IGF2印记丢失与IGF2表达上调相关 |
| 4.3 IGF2表达上调促进肿瘤干细胞自我更新及放化疗抵抗 |
| 4.4 IGF2在维持肿瘤干细胞特性中发挥重要作用 |
| 4.5 IGF2印记丢失机制的研究 |
| 4.6 IGF2印记丢失可以作为鉴别肿瘤干细胞的特征 |
| 4.7 IGF2印记丢失具有潜在临床应用前景 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）小鼠KGF毛囊特异性表达载体构建及转基因ESC的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 实验研究 |
| 第一章 小鼠毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA的构建 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.3 菌种和质粒 |
| 1.4 组织材料 |
| 1.5 基因合成与测序 |
| 2. 方法 |
| 2.1 小鼠KGF基因的分子克隆以及pBlue-KGF克隆载体的构建 |
| 2.2 小鼠UHS基因启动子的克隆以及pMD19-UHS克隆载体的构建 |
| 2.3 中间表达载体pB-UK的构建 |
| 2.4 毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA表达载体的构建 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠肝脏组织总RNA的制备 |
| 3.2 小鼠KGF全长cDNA片段的获得 |
| 3.3 小鼠KGF的T-A克隆及其正向筛选 |
| 3.4 小鼠KGF的PCR产物测序以及比对结果 |
| 3.5 小鼠UHS启动子的克隆以及测序BLAST结果 |
| 3.6 中间载体pB-UK的酶切鉴定分析 |
| 3.7 重组载体pCDsR-UK的酶切分析以及BGH polyA尾的基因合成 |
| 3.8 毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA的酶切鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备及ES细胞的转染条件优化 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 实验材料及细胞系 |
| 1.3 主要试剂和耗材 |
| 1.4 溶液配方 |
| 2. 方法 |
| 2.1 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层的制备 |
| 2.2 小鼠胚胎干细胞的复苏、传代及冻存培养 |
| 2.3 ES细胞的生物学特性检测 |
| 2.4 pCDsR-UKA表达载体的酶切线性化及纯化 |
| 2.5 脂质体Lipofectamine2000转染ES细胞条件的优化 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠胚胎成纤维细胞和SNL细胞生长曲线的测定 |
| 3.2 小鼠饲养层的制作与ES细胞的培养 |
| 3.3 ESC的染色体数目分析 |
| 3.4 ESC的碱性磷酸酶染色分析 |
| 3.5 ESC的Oct-4免疫荧光检测 |
| 3.6 ESC的SSEA-1免疫荧光检测 |
| 3.7 毛囊特异性表达载体的酶切线性化 |
| 3.8 脂质体转染条件的优化 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 转基因ES细胞的筛选扩大培养及其鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 试剂和耗材 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 溶液配方 |
| 2. 方法 |
| 2.1 小鼠胚胎干细胞对G418耐受性的检测 |
| 2.2 转基因ES细胞的筛选及扩大培养 |
| 2.3 转基因胚胎干细胞的检测与鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 ES细胞对G418耐受性的测定 |
| 3.2 稳定表达RFP的小鼠ES细胞克隆的筛选与扩大培养 |
| 3.3 转基因ESC的染色体数目分析 |
| 3.4 碱性磷酸酶的染色分析 |
| 3.5 转基因ES细胞的Oct-4免疫荧光染色 |
| 3.6 转基因ES细胞的SSEA-1免疫荧光染色 |
| 3.7 转基因ES细胞的外源基因PCR鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 图版 |
| 第二部分 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表的学术论文 |
（8）人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 基因组DNA的提取 |
| 1.2 基因扫描分析 |
| 1.3 启动子单体型报告质粒的构建 |
| 1.4 细胞培养和基因转染 |
| 1.5 双荧光素酶报告基因分析 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 不同长度CA微卫星多态性在人群中的频率分布 |
| 2.2 CA微卫星多态性在人群中杂合和均合个体的频率分布 |
| 2.3 杂合个体中两条CA微卫星多态性长度差值的频率分布 |
| 2.4 不同长度CA微卫星多态性P1启动子单体型活力分析 |
| 3 讨 论 |
（9）HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响（论文提纲范文）
| 材 料 和 方 法 |
| 1 主要载体及试剂 |
| 2 HBx蛋白表达载体pEYFP-C1-X的构建 |
| 3 人IGF-II基因P4 启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4的构建 |
| 4 pGL3-P4载体体外甲基化 |
| 5 pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞 |
| 6 pGL3-P4载体细胞转染及瞬时表达 |
| 7 双荧光素酶试验 |
| 8 统计学处理 |
| 结 果 |
| 1 重组质粒pEYFP-C1-X的构建鉴定 |
| 2 P4启动子片段PCR扩增分离及荧光素酶报告载体pGL3-P4的构建鉴定 |
| 3 pGL3-P4载体体外甲基化结果 |
| 4 pEYFP-C1-X在HepG2细胞中的稳定表达 |
| 5 HBx蛋白表达对P4启动子活性影响 |
| 讨 论 |
（10）11p15.5染色体区相关印记基因IGF-2和TSSC3在骨肉瘤中的表达及调控机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 11p15.5 染色体区相关印记基因IGF-2 和TSSC3 在骨肉瘤中的表达及调控机制研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 骨肉瘤中IGF-2 印记基因特异转录本表达及调控机制的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨肉瘤中TSSC3 印记基因表达调控机制及抑癌作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述一 骨肉瘤相关抑癌基因表遗传学研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 甲基化检测技术进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和投稿的论文及获得的奖励 |
| 英文论着 |
四、人胰岛素样生长因子Ⅱ基因P1、P3启动子克隆及意义（论文参考文献）
- [1]糖原合酶激酶-3β乙酰化以及孕期环境丰富在阿尔兹海默病样神经损伤或保护中的作用及机制研究[D]. 周秋至. 华中科技大学, 2019(01)
- [2]调控鸡生殖干细胞分化的lncRNA筛选及PGClnc1功能机制研究[D]. 程少泽. 扬州大学, 2018(01)
- [3]反复种植失败患者子宫内膜KLF12异常高表达抑制胚胎种植的机制研究[D]. 黄晨阳. 南京大学, 2017(05)
- [4]胰岛素样生长因子2在肿瘤干细胞中的印记丢失及机制研究[D]. 赵欣. 吉林大学, 2016(03)
- [5]乙型肝炎病毒X蛋白通过诱导P3启动子低甲基化促进胰岛素样生长因子-Ⅱ基因表达[J]. 汤绍辉,张少华,张小娟,吴胜兰,李俊峰,江向武,周鸿科,罗羽宏,曹明溶. 中华肝脏病杂志, 2014(04)
- [6]人胰岛素样生长因子ⅡP4启动子调控胸苷激酶载体的构建[J]. 周鸿科,杨冬华,汤绍辉,黄卫. 中华肝脏病杂志, 2011(06)
- [7]小鼠KGF毛囊特异性表达载体构建及转基因ESC的筛选与鉴定[D]. 梁伟. 内蒙古大学, 2011(10)
- [8]人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因P1启动子区域CA微卫星多态性对启动子活性的影响[J]. 黄伟,邓亮生,高钟镐,王玉丽,宋影文,郭凯琪,陈晓旋,冯来武. 解放军医学杂志, 2010(09)
- [9]HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响[J]. 汤绍辉,曲春晖,杨敏英,罗羽宏,杨冬华. 中国病理生理杂志, 2010(01)
- [10]11p15.5染色体区相关印记基因IGF-2和TSSC3在骨肉瘤中的表达及调控机制研究[D]. 李懿. 第三军医大学, 2009(05)