一、E-cadherin在非小细胞肺癌中的表达及临床意义（论文文献综述）
章金强,潘朝阳,崔少庸[1]（2021）在《非小细胞肺癌中E-cadherin基因甲基化及蛋白表达的研究》文中进行了进一步梳理目的本实验通过探讨非小细胞肺癌癌组织与相应癌旁组织中E-cadherin（E-cad）基因异常甲基化改变及其蛋白表达的特点,以及其与肺癌发生发展的关系,从而为今后肺癌的诊断,治疗及预后提供新思路。方法应用DNA提取、甲基化特异PCR、蛋白电泳及免疫组化技术对肺癌组织与相应癌旁组织进行相关研究。结果 50例癌组织的E-cadherin蛋白表达阳性率为32%（16/50）,相应的癌旁组织阳性率表达为84%（42/50）;癌组织中E-cadherin蛋白表达显着低于相应癌旁组织蛋白表达（P<0.001）;同时50例癌组织及其对应癌旁组织的甲基化阳性率分别为74%（37/50）、40%（20/50）,癌组织的E-cadherin甲基化阳性率高于相应的癌旁组织（P<0.001）。结论非小细胞肺癌组织中E-cadherin蛋白呈低表达,癌组织的E-cadherin基因启动子存在异常甲基化,E-cadherin基因启动子的异常甲基化可能与E-cadherin蛋白表达下调具有相关性,可作为肿瘤恶性程度的良好指标。
金秋阳[2]（2021）在《Galectin-4与K-Ras结合影响其下游通路激活参与非小细胞肺癌转移的调控机制研究》文中提出研究背景与目的非小细胞肺癌（NSCLC）是世界上最恶性的疾病之一,也是癌症相关死亡的主要原因。由于NSCLC患者生存期较短且治疗风险较大,目前可供选择的治疗方法较少,于是研究NSCLC的发病机制,寻找NSCLC新的生物标志物对于治疗NSCLC具有重要意义。对NSCLC患者进行基因图谱分析得知,表皮生长因子（EGFR）和K-Ras为常见的致癌因子,且两者的表达与NSCLC细胞的转移密切相关。Galectin-4（Gal-4）是串联重复型半乳糖凝集素,在多种肿瘤中被上调,调节肿瘤的增殖、凋亡、侵袭转移等行为。我们课题组前期工作首次发现gal-4在NSCLC中发挥相反的调节作用:在A549和H460细胞中表现为抑制它们的侵袭迁移,而在H1299和Calu-1细胞中表现为促进侵袭迁移,这种作用可能与Ras蛋白相关,但具体机制不明。本论文旨在针对NSCLC中最常见的致癌因子K-Ras,研究gal-4与K-Ras及其下游信号通路之间的相互作用,深入探讨与NSCLC侵袭迁移相关的分子调控机制,研究gal-4参与调控NSCLC转移中的作用及其机制,为将gal-4作为非小细胞肺癌治疗的生物标志物及治疗策略,提供初步的实验基础和理论依据。实验方法和结果实验方法:1.检测细胞内gal-4对于K-Ras生物学活性的调节作用文章采用四种NSCLC细胞（A549,H460,H1299,Calu-1）为研究对象,首先提取其RNA采用PCR-限制性片段长度多态性分析（RFLP）分析四种NSCLC细胞的K-Ras基因型;随后采用转染siRNA或过表达质粒的方法分别降低或升高gal-4在四种细胞内的表达,并采用Western blot实验分别检测K-Ras以及gal-4的表达水平。接下来为观察gal-4对于K-Ras细胞膜定位的作用,采用转染siRNA的方法沉默gal-4,分别提取胞膜和胞浆蛋白,采用Western blot实验以及免疫荧光实验共同确定胞膜和胞浆中K-Ras的表达水平。随后,采用免疫荧光实验检测K-Ras与gal-4在四种NSCLC细胞中的表达分布,采用免疫共沉淀实验检测gal-4与K-Ras形成复合体的情况。为进一步研究gal-4对于K-Ras的调节作用,使用siRNA技术和EGFR的激活剂EGF,采用Western blot实验检测K-Ras,gal-4,EGFR,p-EGFR的表达情况。2.Gal-4对NSCLC侵袭迁移的相反调节机制与K-Ras/c-raf/MEK/ERK信号通路相关性研究文章采用计算机模拟辅助建模以及过表达gal-4后免疫共沉淀实验检测gal-4对于K-Ras/c-raf复合体的作用;siRNA沉默gal-4后,采用Western blot实验检测c-raf,MEK1/2,p-MEK1/2,ERK,p-ERK 的表达;引入MEK1/2 抑制剂 Pimasertib,使用划痕实验和Transwell实验探究其对于四种NSCLC细胞的迁移和侵袭的作用;采用Western blot实验检测这种调控作用对于上皮间质转化（EMT）标志物及相关分子表达水平的影响;MEK1/2抑制剂Pimasertib作用于gal-4干扰后的NSCLC细胞,采用划痕实验和Transwell实验,进一步检测MEK1/2在gal-4调控不同细胞侵袭迁移能力中发挥的作用。3.Gal-4对NSCLC侵袭迁移的相反调节作用与K-Ras/JNK/c-Jun通路的表达与激活相关性研究在四种NSCLC细胞中干扰gal-4后,通过Western blot实验检测gal-4对于JNK和c-Jun的表达与磷酸化激活的作用;随后,通过免疫荧光实验检测gal-4对p-c-Jun入核的影响;为了探究此通路与侵袭迁移的作用,引入JNK抑制剂SP600125,通过划痕实验和transwell实验验证JNK在四种NSCLC细胞侵袭迁移中的作用,通过Western blot实验检测加入JNK抑制剂SP600125后EMT相关分子的表达变化;最后通过在gal-4干扰后的NSCLC细胞中加入JNK抑制剂SP600125,通过划痕实验和transwell实验进一步检测JNK通路在gal-4调控不同NSCLC细胞的相反侵袭迁移能力中发挥的作用。4.检测gal-4对H460和Calu-1细胞在裸鼠体内肺转移的影响体内实验选取了具有代表性的高表达gal-4的突变型K-Ras细胞H460与低表达gal-4的野生型K-Ras细胞Calu-1细胞观察细胞内gal-4对两种细胞在裸鼠体内肺转移的影响。体内实验中,预先在体外干扰H460以及Calu-1细胞中gal-4的表达,经裸鼠尾静脉注射已干扰处理或未经处理的H460细胞和Calu-1细胞,随机分组且每种细胞设置si-gal-4组和对照组。每三天称量裸鼠体重并观察其生长状态,待裸鼠肺部转移明显,剖取裸鼠肺组织,于体式显微镜下观察其肺部肿瘤转移灶点。之后取相同重量的对照组肺组织进行PCR-RFLP实验,分析两种细胞的基因型;将不同组的裸鼠肺组织制成冷冻切片,进行H&E染色实验及免疫荧光实验,分析肺部瘤组织及黏附分子的表达情况。结果:1.Gal-4抑制A549和H460细胞中K-Ras表达与细胞膜聚集;促进H1299和Calu-1细胞中K-Ras表达与细胞膜聚集。PCR-RFLP实验结果显示,A549和H460细胞为突变型K-Ras,而在H1299和Calu-1细胞表现为野生型K-Ras;Western blot结果显示,在四种细胞中转染siRNA后能降低gal-4的表达,而转染质粒后可以升高ga1-4的表达;在转染siRNA干扰gal-4后,A549和H460细胞中K-Ras的表达上升,而H1299和Calu-1细胞中K-Ras的表达下降;随后,为了探究gal-4对于K-Ras表达是否为直接调节,选择K-Ras重要上游激活因子EGFR,加入siRNA和EGFR的激活剂EGF后Western blot实验结果显示,干扰gal-4后四种NSCLC细胞中EGFR的表达水平变化不明显,而促进A549和H460细胞中EGFR的激活,抑制H1299和Calu-1细胞中EGFR的激活,但在激活EGFR后,四种细胞的K-Ras表达无明显变化,说明gal-4对K-Ras表达的调节作用与EGFR无关;接下来,免疫荧光实验以及胞膜胞质蛋白的Western blot实验结果表明:沉默gal-4后,K-Ras的表达在A549和H460细胞的细胞膜上增多,在这两种细胞的胞质中下降;而在H1299和Calu-1细胞的细胞膜上减少,在其胞质中增多。这说明gal-4可调节K-Ras在NSCLC细胞内的表达水平及其向细胞膜的转移。2.NSCLC细胞内gal-4与K-Ras直接结合并影响其与下游效应子c-raf的结合免疫荧光实验显示,在四种NSCLC细胞中gal-4与K-Ras存在共定位现象,提示两者可能存在直接相互作用;通过计算机辅助建模模拟,分子对接结果发现gal-4与不同表型K-Ras可发生结合;随后,免疫共沉淀实验结果说明gal-4与K-Ras在NSCLC中形成复合体,且在A549和H460细胞中,过表达gal-4后,gal-4/K-Ras复合体形成增多;而在H1299和Calu-1细胞中,gal-4/K-Ras复合体形成减少。为了进一步探究gal-4/K-Ras复合体对于K-Ras下游效应子的作用,首先采用计算机辅助建模在K-Ras/c-raf模型中加入gal-4分子,结果显示三者存在共结合区域;接下来,在四种NSCLC细胞中沉默gal-4后Western blot实验结果显示c-raf的表达水平在A549和H460细胞中升高,而在H1299和Calu-1细胞中的表达水平降低;过表达gal-4后,免疫共沉淀实验结果显示,在A549和H460细胞中K-Ras/c-raf复合体表达减少,而在H1299和Calu-1细胞中表达增多。以上结果说明gal-4可以通过与K-Ras直接结合继而调节其下游效应子的活性。3.细胞内gal-4调控K-Ras/c-raf/MEK/ERK通路的激活来调节NSCLC细胞的侵袭迁移Western blot实验结果显示,在NSCLC细胞中沉默gal-4后,MEK1/2和ERK的磷酸化水平在A549和H460细胞中升高,在H1299和Calu-1细胞中降低;引入MEK1/2抑制剂Pimasertib,划痕实验和transwell实验结果显示MEK1/2抑制剂Pimasertib抑制四种NSCLC细胞的迁移侵袭,加入Pimasertib后提取细胞总蛋白进行Western blot实验,结果表明Pimasertib升高四种NSCLC细胞的E-cadherin 的表达,而降低 N-cadherin,CD44,vimentin,MMP-2,β-catenin 的表达;随后,在干扰gal-4的NSCLC细胞中加入MEK1/2抑制剂Pimasertib后,采用划痕和transwell实验,结果发现,与gal-4干扰组相比,MEK1/2抑制剂Pimasertib和si-gal-4共同作用后的NSCLC细胞其迁移和侵袭速率降低,提示gal-4通过调节K-Ras/c-raf/MEK/ERK的磷酸化而调节NSCLC细胞的侵袭迁移。4.细胞内gal-4通过K-Ras/JNK/c-Jun通路参与调节NSCLC细胞的侵袭迁移干扰gal-4后,Western blot实验结果表明在A549和H460细胞中JNK和c-Jun的磷酸化水平上升,而在H1299和Calu-1细胞中二者的磷酸化水平下降;免疫荧光实验结果显示在A549和H460细胞中干扰gal-4后p-c-Jun入核增多,而在H1299和Calu-1细胞中p-c-Jun入核减少。接下来引入JNK抑制剂SP600125,划痕实验和transwell实验结果表明加入JNK抑制剂SP600125后四种细胞的侵袭迁移能力下降;Western blot实验表明JNK抑制剂SP600125可以增加E-cadherin 的表达,降低 N-cadherin,β-catenin,CD44,MMP-2 的表达。为了进一步探讨JNK在gal-4调节细胞侵袭迁移的作用,在干扰gal-4后加入JNK抑制剂SP600125,划痕实验和transwell实验结果显示,与gal-4干扰组比较,加入JNK抑制剂SP600125的gal-4干扰组细胞的迁移和侵袭能力降低,表明gal-4可以通过调节K-Ras/JNK/c-Jun通路的激活而调节细胞的侵袭迁移。5.干扰gal-4可促进H460细胞在裸鼠体内的肺转移,而抑制Calu-1细胞在裸鼠体内的肺转移。体内实验结果表明,尾静脉注射si-gal-4处理后的H460细胞,25天后解剖裸鼠发现其肺转移结节数量相较于未干扰组明显增多;而尾静脉注射si-gal-4处理后的Calu-1细胞,解剖后发现其肺转移结节数量明显少于未干扰组。H&E染色实验结果显示,注射si-gal-4的H460细胞的裸鼠,其肺部的瘤组织比未干扰组增多;而尾静脉注射si-gal-4的Calu-1细胞的裸鼠,其肺部的瘤组织相较于未干扰组明显减少。免疫荧光实验检测黏附分子表达,结果显示注射干扰gal-4后的H460细胞,相较于对照组,其N-cadherin表达增多而E-cadherin表达减少;而注射干扰gal-4后的Calu-1细胞,其N-cadherin的表达则少于对照组。以上结果提示在裸鼠体内,gal-4可抑制H460细胞的肺转移,而促进Calu-1细胞的肺转移。实验结论1.在A549和H460细胞中,gal-4可以下调K-Ras的表达、抑制K-Ras向细胞膜定位、直接与K-Ras结合并抑制其与下游效应子c-raf的结合,以此来抑制K-Ras的生物学活性;而在H1299和Calu-1细胞中,gal-4可以上调K-Ras的表达、促进K-Ras向细胞膜转移及K-Ras/c-raf复合体的形成,从而促进K-Ras的激活及信号传递。2.在A549和H460细胞中,gal-4可抑制K-Ras/c-raf/MEK/ERK的激活,从而上调 E-cadherin,下调 N-cadherin,vimentin,β-catenin,CD44,MMP-2 的表达而抑制上皮间质转化,继而减弱该细胞的侵袭迁移能力;在H1299和Calu-1细胞中,gal-4 激活 K-Ras/c-raf/MEK/ERK,上调 N-cadherin,vimentin,MMP-2,β-catenin,CD44的表达而促进上皮间质转化,从而促进细胞的侵袭迁移。3.在A549和H460细胞中,gal-4可抑制JNK和c-Jun的激活,继而抑制p-c-Jun的入核,从而上调 E-cadherin,下调 N-cadherin,β-catenin,CD44,MMP-2 的表达,从而抑制细胞的侵袭迁移;在H1299和Calu-1细胞中,gal-4可促进JNK和c-Jun的激活以及p-c-Jun的入核,从而增加N-cadherin,MMP-2,β-catenin,CD44的表达,继而推动了 NSCLC细胞的侵袭迁移。4.体内实验验证了 gal-4可抑制K-Ras突变型H460细胞的转移,而促进K-Ras野生型Calu-1细胞的转移。
魏学强[3]（2021）在《WSB2在宣威肺癌增殖及迁移中的作用及机制研究》文中研究指明[背景和目的]肺癌是死亡率、发病率较高的恶性肿瘤,每年因患肺癌导致的死亡人数居高不下,目前对于它的发生、发展具体机制尚不清楚,因此进一步深入探讨肺癌发生和发展的机制对进行针对性地诊治有极大好处。区别于国外及国内其他地域的肺癌高发情况,云南省东北部的肺癌高发表现出其自身特点,呈点状极为集中的分布,主要集中的地区是宣威和个旧两个地级市范围,尤其是宣威地区肺癌又是国内乃至全球发病率及死亡率极高的恶性肿瘤,是全球点状区域性高发肺癌研究的代表性地区疾病。所谓宣威肺癌即是高发生率发生在该地区,并在当地出生,居住≥3代的肺癌患者。而“宣威地区”广义上泛指珠江源地区,包括宣威市、麒麟县、富源县、马龙县、沾益县及贵州西南部等地域,位于中国西南部及云南省东北部乌蒙山区,当地富藏铁、铜、煤等矿产资源,拥有人口约310万,土地面积6069.88平方公里,尤其是最为高发的区域为宣威市（距省会昆明市260公里,是云南人口最多的县级市,是属于国内200个主要产煤县市）,包括榕城、靖外、来宾、格宁、热水等14个镇、8个乡、25个居委会和331个行政村,全市人口约129.75万人。因当地煤炭资源丰富,居民习惯就地取材,以当地的烟煤作为主要生活燃料,住宅多为云南地区的传统建筑结构,为一楼一底土木结构,由于无排烟设备系统,室内长期空气流通不畅,燃烧燃料排放的大量烟尘使屋内空气污染严重,这可能和导致宣威肺癌的高发生率的原因息息相关。1975年统计的关于全国肿瘤死亡情况表明,宣威市农民肺部恶性肿瘤致死百分比较高,并且特别显着,从这一发现开始,由此拉开了宣威肺癌研究的序幕,自此宣威肺癌引起了国内及全球研究者的重视。全国三次死因回顾调查显示:宣威地区肺癌死亡百分比从二十世纪70年代以来持续升高。当地市疾控中心资料显示:1990年到1992年,宣威肺癌死亡十万分比为23.14/10万,男、女死亡百分比分别为4倍和8倍于国内平均值。2014年和其后一年,宣威地区肺癌死亡率为9.111/1万,男、女死亡率分别为国内平均死亡率的3倍和6倍,比较两个时间点,后者较90年代又提高近4倍。而就目前对癌症的研究,基因改变是肿瘤发病的一个重要因素,因此,寻找宣威肺癌相关基因同样是了解宣威肺癌的发病机制及深入研究的关键,为其早期诊治的进行提供有效途径。色氨酸-天冬氨酸重复序列及C-末端细胞因子信号传导的抑制因子WSB2（WD repeat and SOCS box containing protein2）根据其特殊结构,将其命名为包含WD 重复序列及SOCS 盒蛋白（WD repeat andSOCS box containing protein,WSB）结构的基因。根据WD基序的数量,WSB又分为WSB1和WSB2。而WD重复序列是指包含多个色氨酸-天冬氨酸基因的重复序列（WD repeat）,SOCS盒又是指一种C-末端的细胞因子信号传导的抑制因子盒（suppressor of cytokine signaling box,SOCS box）。这两种结构在癌症的形成及成长过程中很明显的担任主角,且参与形成多种类型恶性肿瘤,具体机制尚未被明确的确定,有研究认为SOCS盒的蛋白可通过促进ElonginB/C-Cullin2复合物的形成,从而激活了相关的致癌基因并导致肿瘤发生。因WSB2的蛋白质同样也含有SOCS盒结构,所以引起了研究者的关注。本研究的目的:通过TCGA数据库下载肺癌中色氨酸-天冬氨酸重复序列及C-末端细胞因子信号传导的抑制因子WSB2表达情况的数据,分析宣威肺癌患者体内WSB2的表达情况,以及WSB2表达水平与其临床分期与预后相关性。同时利用体内和体外实验研究了 WSB2对宣威肺癌侵袭、增殖、迁移及凋亡方面的影响,探讨了WSB2通过调控Wnt/β-catenin信号通路的功能及其在宣威肺癌中的功能。通过以上研究验证WSB2在宣威肺癌中扮演的角色及其作用机制,以期能够进一步为宣威地区肺癌的防治、诊疗工作拓展新的方法。第一部分WSB2在宣威肺癌组织中的表达及临床意义[目的]分析与检测宣威病例癌组织和正常肺组织中WSB2表达情况。[方法]1.由TCGA表达谱下载肺癌病例中WSB2的表达水平情况,同时筛选出临床资料、生存资料完整和存活期超过2个月的病例,用于分析COX多因素风险模型比例和后续生存曲线。2.收集在昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）胸外一科行手术治疗的宣威肺癌患者癌变部位组织和配对远端正常肺组织样本共42例,苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色对宣威肺癌病理形态进行鉴定;免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测及免疫印迹（WB,Western Blotting）分析研究宣威肺癌患者病变部位和正常肺组织中WSB2的表达情况。[结果]1.生物信息学分析显示:WSB2在肺鳞癌组织中较腺癌高表达,而且和肺癌的临床分期及预后显着关联（P<0.05）。2.收集昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）胸外一科行手术治疗的宣威肺癌患者癌组织和配对远端正常肺组织样本共42例,采用免疫组织化学染色（IHC）显示:宣威肺癌癌组织中WSB2阳性率高于正常肺组织（83.3%VS.26.2%,p=0.007,<0.01）。3.对上述样本行Western Blotting检测验证宣威肺癌中WSB2蛋白表达水平,数据表明:这些病例癌部位组织中WSB2蛋白表达水平显着比正常肺组织要高（P<0.01）。4.同时对上述样本行q-PCR检测验证患者病变部位癌组织中WSB2基因表达情况,数据表明:宣威肺癌患者病变部位组织中WSB2基因表达水平比正常部位肺组织明显高（P<0.01）。5.对宣威肺癌患者临床基本资料和分期在免疫组化中WSB2的阳性率进行比较,结果显示:分期为Ⅰ期病例的组织样本的阳性率低于ⅢA期,存在统计学差异（P<0.05）。[结论]WSB2在宣威肺癌病变部位组织中呈高表达,其也许在该种肺癌的发生、发展中起着重要作用,宣威肺癌患者的分期和生存率与其表达密切相关。第二部分在宣威肺癌细胞XWLC-05及裸鼠体内WSB2的生物学功能研究[目的]第一部分研究中发现WSB2是在宣威肺癌癌组织中高表达的基因,其蛋白表达升高提示患者预后不良。为证实WSB2在宣威肺癌中恶性生物学行为导致患者出现这一系列临床病理特征,本论文进一步探讨在宣威肺癌细胞系XWLC-05里WSB2与细胞迁移、增殖、凋亡及侵袭的关系,并采用裸鼠移植瘤实验研究WSB2在体内环境下对宣威肺癌的影响。旨在获得WSB2促进宣威肺癌肿瘤发生、发展等恶性进程的可靠证据,为WSB2成为宣威肺癌治疗的新靶标提供科学依据。[方法]1.为了敲减XWLC-05细胞中WSB2基因并使其编码蛋白表达降低,抑制WSB2的表达,本部分研究通过WSB2-shRNA慢病毒干扰载体感染构建WSB2敲减XWLC-05稳转细胞株。2.利用CCK-8法对细胞的增殖进行检测,对细胞凋亡采用流式细胞术进行检测,Transwell转移小室实验和细胞划痕实验对细胞的侵袭和迁移能力进行检测。Western Blotting检测了“EMT”过程相关蛋白的表达水平。3.为进一步验证WSB2在体内对XWLC-05细胞的作用是否与体外一致,本研究采用WSB2敲减的XWLC-05细胞株,构建了裸鼠异种定植瘤模型。对WSB2敲减和XWLC-05细胞成瘤作用影响进行了检测。[结果]1.在宣威肺癌细胞系中,WSB2敲减后显着抑制XWLC-05细胞增殖（P<0.05）2.在宣威肺癌细胞系中,WSB2敲减后细胞凋亡率呈显着上升（P<0.05）;3.宣威肺癌细胞系WSB2敲减后,细胞迁移能力和侵袭性呈显着下调（P<0.05）。4.宣威肺癌细胞系中,WSB2敲减后,N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显着下降（P<0.01）;E-cadherin的蛋白水平显着升高（P<0.01）。5.裸鼠体内实验中,WSB2敲减后XWLC-05细胞成瘤能力得到明显下降（P<0.05）。[结论]1.下调WSB2能使XWLC-05细胞的迁移、增殖和侵袭能力都骤减,凋亡率明显升高,WSB2扮演着促进宣威肺癌发生、发展及侵袭的角色。2.WSB2在裸鼠体内同样可促进宣威肺癌的生长。第三部分WSB2激活Wnt/β-Catenin信号通路促进宣威肺癌细胞增殖、迁移的机制研究[目的]前面研究中探索出WSB2可能具有刺激宣威肺癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用,本部分研究拟采用构建WSB2过表达的XWLC-05稳转细胞株,并同时对照采用Wnt/β-Catenin信号通路阻碍剂FH535作用XWLC-05的细胞,初步探讨WSB2通过Wnt/β-Catenin途径促进宣威肺癌肿瘤细胞增殖、迁移可能的分子机制,旨在为WSB2成为宣威肺癌治疗的新靶标提供科学的理论依据。[方法]构建XWLC-05稳转细胞株,使WSB2处于过表达状态,并采用Wnt/β-Catenin信号通路阻碍剂FH535处理XWLC-05细胞进行对照,同样利用CCK-8法分析细胞增殖,Transwell转移小室实验细胞和划痕实验分析细胞的侵袭和迁移能力。Western Blotting检测了“EMT”过程和Wnt/β-catenin途径相关蛋白表达水平,从而探讨WSB2通过Wnt/β-catenin途径对于宣威肺癌有何功能。[结果]1.WSB2过表达能显着提升XWLC-05细胞增殖、迁移能力和侵袭性（P<0.05）,而Wnt/β-Catenin途径阻碍剂FH535能显着下调WSB2的促进作用（P<0.01）。2.敲降WSB2基因表达水平后,c-Myc和β-Catenin蛋白水平显着降低（P<0.01）;而WSB2基因过表达后,c-Myc和β-Catenin蛋白水平显着升高（P<0.01）。WSB2可以调节Wnt/β-Catenin信号转导中两个关键蛋白c-Myc和β-Catenin的表达情况。3.WSB2过表达后,N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;E-cadherin的蛋白表达水平显着降低（P<0.01）。抑制剂FH535处理后,N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;E-cadherin的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）。[结论]1.WSB2通过调节Wnt/β-Catenin信号传导调节宣威肺癌细胞生长和转移。2.WSB2的过度表达也导致Wnt/β-Catenin信号的激活。此外,Wnt/β-Catenin途径的抑制剂FH535能减轻WSB2过度表达引起的宣威肺癌。3.WSB2通过刺激Wnt/β-catenin途径,对宣威肺癌有激发作用,也许可成为宣威肺癌的医治靶标。
陈小波[4]（2021）在《miR-9-5P在非小细胞肺癌和血管生成拟态中的作用研究》文中指出[背景与目的]1999年Maniotis[1]]第一次在高侵袭性的黑色素瘤中发现了一种新的管道样结构,被称为血管生成拟态（vasculogenic mimiory VM）。构成血管生成拟态的管壁如:层粘连蛋白、肝素硫酸盐蛋白多糖、Ⅳ胶原蛋白等是富含PAS染色阳性的细胞外基质,其血管内皮细胞特异标记免疫组化染色（FVlllRag、Ules、cD31、CD34、KDR等）阴性。这些通道与肿瘤血管相连,为肿瘤组织提供血供。血管生成拟态与内皮依赖血管最显着区别是,内皮细胞围成的血管CD31染色阳性而PAS染色阴性,而血管生成拟态管壁呈PAS阳性而CD31染色阴性。miRNAs与血管生成拟态在恶性肿瘤的转移中起着重要作用,相关研究发现miRNAs可以通过调节血管生成拟态的形成而引起恶性肿瘤侵袭性、转移能力的改变。但血管生成拟态和miRNAs之间的具体关系以及调控信号通路尚未明确。我们研究团队前期研究发现:肺癌患者血液中miR-9-5P较肺良性肿瘤患者显着上调、miR-9-5P在肺癌癌组织中较癌旁正常肺组织中显着上调。相关研究报道miR-9-5P可以调节恶性肿瘤血管生成拟态的形成,但在肺癌研究中的相关报道很少。本研究拟测定NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态的形成情况,通过体内、体外实验,探究上调、下调miR-9-5P对NSCLC增殖、迁移、侵袭等和血管生成拟态形成的影响,初步探究miR-9-5P的靶基因及相关通路,探讨miR-9-5P在NSCLC中扮演的角色及其作用机制,希望为肺癌诊断、靶向药物设计提供实验依据。[方法]1.人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义收集60例手术治疗的NSCLC癌组织及配对远端正常肺组织,应用qPCR检测NSCLC癌组织及配对远端正常肺组织中miR-9-5P的表达情况,并分析其与临床病理特征之间的关系;应用免疫组化、CD31/PAS双重染色方法检测NSCLC癌组织中血管生成拟态的形成情况,并分析其与临床病理特征之间的关系。2.miR-9-5P对NSCLC细胞生物学功能的影响以A549、NCI-H1299为实验细胞株,通过质粒转染的方法分别上调及下调miR-9-5P,并筛选出相应的稳定转染细胞株,qPCR验证miR-9-5P转染效率;CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕试验、Transwell侵袭试验、细胞凋亡检测实验、三维细胞培养实验检测miR-9-5P对NSCLC的增殖、克隆、迁移、侵袭、凋亡及管道形成能力的影响。3.miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制研究应用TargetScan、PicTar和miRanda基因预测软件筛选miR-9-5P的靶基因,再用双荧光素酶报告基因实验进行验证;Western Blot检测稳定上调、下调miR-9-5P的NSCLC细胞株中E-cadherin的表达;Western Blot检测不同miR-9-5P水平的肺癌癌组织中E-cadherin的表达,验证miR-9-5P与E-cadherin的相关性。Western Blot检测稳定上调、下调miR-9-5P的NSCLC细胞株中血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达;Western Blot检测不同miR-9-5P水平的肺癌癌组织中VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达,验证miR-9-5P对NSCLC中血管生成拟态相关蛋白的影响。4.miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤和移植瘤中血管生成拟态形成的影响研究以稳定上调、下调miR-9-5P的A549、NCI-H1299为实验细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤模型,比较上调、下调miR-9-5P对NSCLC细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响;应用免疫组化、CD31/PAS双染检测不同miR-9-5P水平移植瘤中血管生成拟态的形成情况,比较上调、下调miR-9-5P对裸鼠移植瘤中血管生成拟态形成能力的影响;免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤中EMT发生的关键蛋白E-cadherin的表达情况;免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤中血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达情况,比较上调、下调miR-9-5P对裸鼠移植瘤中EMT关键蛋白E-cadherin和血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的影响,进一步验证miR-9-5P对NSCLC和血管生成拟态形成的影响。[结果]1.人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义NSCLC患者的癌组织中miR-9-5P较癌旁正常肺组织明显上调;miR-9-5P上调明显组与miR-9-5P上调不明显组相比:鳞癌比率更高、Ⅲ期比率更高,但差异无统计学意义（P>0.05）,低分化癌比率更高（P<0.05）。NSCLC患者的癌组织中有血管生成拟态形成,低分化肿瘤较中高分化肿瘤更容易形成血管生成拟态（P<0.01）;Ⅲ期肿瘤较Ⅰ+Ⅱ期肿瘤更容易形成血管生成拟态（P<0.0 1）。血管生成拟态阳性组癌组织中miR-9-5P较血管生成拟态阴性组明显上调。miR-9-5P和血管生成拟态是NSCLC病理差分化的一个指标,两者成正相关。2.miR-9-5P对NSCLC细胞生物学功能的影响与对照组相比,上调miR-9-5P后促进了 A549和H1299细胞的增殖能力,而且随着培养时间延长,差异越明显。上调miR-9-5P后促进了 A549和H1299细胞的克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力和管道形成能力;下调miR-9-5P后结果与上述结果相反。但上调、下调miR-9-5P后A549和H1299细胞均未出现明显的细胞凋亡现象。3.miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制生物信息预测E-cadherin是miR-9-5P的潜在靶基因之一,双荧光素酶报告基因实验验证miR-9-5P可直接靶向作用于E-cadherin。Western Blot检测NSCLC肺癌组织中血管生成拟态相关蛋白发现:miR-9-5P上调明显组癌组织中E-cadherin的表达高于上调不明显组、VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达低于上调不明显组。Western blot检测A549、H1299细胞株发现:上调miR-9-5P的细胞株E-cadherin蛋白表达量出现明显下降,而MMP2、MMP9、VE-cadherin表达量出现上升,下调miR-9-5P细胞株E-cadherin蛋白表达量出现明显上升,而MMP2、MMP9、VE-cadherin表达量出现下降。4.miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤模和移植瘤中血管生成拟态形成的影响裸鼠移植瘤实验发现:与对照组相比,上调、下调miR-9-5P组裸鼠体重增长、成瘤能力无差异;下调miR-9-5P组移植瘤生长速度慢、肿瘤体积小,质量轻;上调miR-9-5P组与对照组相比未见差异。裸鼠移植瘤组织免疫组化、CD31/PAS双染发现:移植瘤肿瘤中有血管生成拟态形成。但因例数少（每组6例）,各组间无差异。免疫组化、Western Blot检测裸鼠移植瘤组织中EMT发生的关键蛋白E-cadherin和血管生成拟态相关蛋白发现:上调miR-9-5P组EMT发生的关键蛋白E-cadherin表达降低;血管生成拟态相关蛋白MMP2、MMP9和VE-cadherin表达升高,下调miR-9-5P组结果与上述结果相反。[结论]1.miR-9-5P、血管生成拟态形成与NSCLC肿瘤分化程度、病理分期等呈负相关,两者之间呈正相关,miR-9-5P上调、血管生成拟态形成可能是临床预后不良的一个指标。2.抑制miR-9-5P能抑制NSCLC的增殖、克隆、迁移、侵袭和管道形成能力,并且能减慢裸鼠移植瘤生长,提示miR-9-5P有可能作为肺癌治疗的一个潜在靶点。3.miR-9-5P降低NSCLC EMT发生的关键蛋白E-cadherin的表达,增加血管生成拟态相关蛋白VE-cadherin、MMP2、MMP9的表达,EMT通路可能是miR-9-5P调节NSCLC生长和血管生成拟态形成的信号通路之一。
林兰岚[5]（2021）在《ARHGAP10在非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用及机制研究》文中研究表明研究背景与目的:肺癌是全球主要的恶性肿瘤,非小细胞肺癌（Non-small C ell Lung Cancer,NSCLC）作为肺癌典型的病理组织学类型之一,在原发性肺癌病例中诊断率超过85%。NSCLC常规的治疗方案主要采取以手术、化疗和放疗为主的多学科综合治疗模式,但是因其具有高度侵袭性和转移性,非小细胞肺癌的五年生存率尚未取得较为满意的效果。尽管近几年来靶向治疗和免疫治疗的出现较明显改善了肺癌的疗效,然而其耐药性及其不良反应在部分程度上限制了非小细胞肺癌患者的治疗效果。因此,从分子水平深入探索肺癌的发生发展机制,筛选和鉴定调控肺癌侵袭转移的潜在致病基因有助于在临床实践中早期发现非小细胞肺癌。上皮间质转化（Epithelial M esen ch ym al Tr an si tion,E M T）作为促进癌细胞发生侵袭和迁移的主要机制之一,是非小细胞肺癌发生转移的起始和关键性因素,据报道ARHGAP10在肿瘤细胞迁移、粘附和肌动蛋白细胞骨架动态重组等多种生物学行为中具有着十分重要的作用,然而,ARHGAP10表达与非小细胞肺癌细胞上皮间质转化间的相关性尚不清楚,有待进一步探索。在本研究中,我们探讨ARHGAP10参与调控非小细胞肺癌EMT的进程与肿瘤发生的机制。方法:1.应用RT-q PCR和Western blot检测正常人肺上皮细胞BEAS-2B和SK-MES-1、A549、H1299、H1975等非小细胞肺癌株中ARHGAP10的m RNA和蛋白表达情况;2.通过慢病毒（Lentivirus）包装、感染及筛选等步骤构建稳定过表达ARHGAP10的NSCLC细胞株A549和H1299,si RNA干扰体系构建瞬时敲减ARHGAP10的NSCLC细胞H1975,对构建的非小细胞肺癌细胞株进行实验分组如下:将过表达或敲减ARHGAP10基因的NSCLC细胞株定义为过表达组（A549-ARHGAP10、H1299-ARHGAP10）和干扰组（H1975-si ARHGAP10）,将空载体的NSCLC细胞株定义为对照组（A549-mock、H1299-mock、H1975-si NC）;3.采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）、Transwell侵袭实验、细胞划痕技术测定ARHGAP10基因对NSCLC细胞的增殖活力、侵袭及迁移能力的影响;PhalloidinFITC荧光染色检测ARHGAP10基因对NSCLC细胞伪足形成和骨架重塑的影响;4.运用Western blot和免疫荧光检测A549-ARHGAP10、A549-mock和H1299-ARHGAP10、H1299-mock中EMT蛋白（E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail）的表达情况以及信号转导通路PI3K/Akt/GSK3β轴关键标志蛋白的表达水平;使用100ng/ml的IGF-1孵育细胞24h后检测不同分组细胞株中EMT标志蛋白的表达水平及对细胞增殖、侵袭的影响。结果:1.A549、H1299、H1975、SK-MES-1中ARHGAP10表达显着低于正常肺上皮,成功地建立了ARH GAP10稳定过表达NSCLC细胞株和ARH GAP10瞬时敲减NSCLC细胞株;2.ARHGAP10基因过表达的A549和H1299细胞增殖、侵袭和迁移水平显着降低,而ARHGAP10基因敲减的H1975细胞结果完全相反;细胞骨架实验显示过表达ARHGAP10后,细胞骨架纤维及伪足等明显减少,提示过表达ARHGAP10基因对细胞运动能力起抑制作用;3.Western blot和免疫荧光结果表明,在ARHGAP10过表达的NSCLC细胞中,EMT标志性蛋白E-Cadherin表达显着上调,然而S nail、N-Cad herin和Vimen tin等蛋白的表达明显下调。同时我们进一步探讨了ARH GAP10参与EMT的机制,发现PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路中关键标志蛋白PI3 K、p-Akt和p-GSK3β的表达水平显着下调。提示ARHGAP10可能通过PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路抑制NSCLC细胞EMT的过程,进一步通过挽救实验发现加入PI3K/Akt通路激活剂IGF-1（100ng/ml）后可以显着回复ARHGAP10对NSCLC细胞EMT的抑制作用。结论:研究结果表明ARHGAP10在非小细胞肺癌细胞中显着低表达,并与非小细胞肺癌细胞EMT密切相关。过表达ARHGAP10基因可显着抑制非小细胞肺癌细胞增殖,削弱非小细胞肺癌细胞侵袭及迁移能力;敲减ARHGAP10则表现出相反的结果。进一步研究结果表明ARHGAP10可通过调节PI3K/Akt/GSK3β轴信号转导通路抑制NSCLC上皮间质转化,从而有效抑制NSCLC细胞恶性生物学行为。
程丽芳[6]（2020）在《GBP1通过PGK1激活EMT通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的功能和机制研究》文中提出研究背景肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,虽然治疗方法多样,但其死亡率仍然居高不下。非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型。厄洛替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）,它作为一个晚期EGFR驱动基因阳性非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者一线治疗的首选药物,其使用明显提升此类患者的临床结局。但经历约10月的中位无进展生存期（progression-free survival,PFS）后,EGFR-TKI耐药不可避免成为临床常见的难题之一。至今,已提出MET扩增、ERBB2扩增、K-RAS突变或PTEN缺失等多种机制参与EGFR-TKI耐药,但仍有一些机制不明。因此,进一步探讨厄洛替尼耐药是需要解决的重要问题。本研究通过Gene expression omnibus（GEO）数据库预测了鸟苷酸结合蛋白1（guanylate binding proteinl,GBP1）可能是一个与厄洛替尼耐药相关的癌基因。通过单因素和多因素回归分析确认GBP1与NSCLC患者预后差相关。接着我们通过逐级增加厄洛替尼浓度增加而建立厄洛替尼耐药株,并使用这些细胞分析沉默或过表达GBP1和厄洛替尼耐药的关系,从而确认GBP1参与厄洛替尼耐药。为了探索GBP1在厄洛替尼耐药中具体作用机制,我们进行免疫共沉淀实验和免疫荧光共定位实验分析GBP1和磷酸甘油激酶1（phosphoglycerol kinase 1,PGK1）是否存在互作关系。最后,我们探索PGK1参与厄洛替尼耐药的下游信号通路,通过回复和免疫组化（IHC）实验证实GBP1通过PGK1激活上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。研究目的1,体内、体外实验探讨GBP1是否参与非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。2,探讨GBP1参与调控非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的分子机制。3,探讨GBP1表达与非小细胞肺癌患者生存、临床特征的关系。研究方法第一部分体外研究1 GBP1参与厄洛替尼耐药的实验1.1细胞毒性实验（CCK-8）比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞的半数抑菌浓度（IC50）。1.2荧光定量PCR实验（qRT-PCR）比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞GBP1基因的mRNA水平。1.3 Mann-Whitney检测GBP1的mRNA水平与厄洛替尼耐药的相关性。1.4 T790M位点突变检测试剂盒检测耐药细胞是否存在T790M位点突变。1.5利用单因素和多因素Cox回归分析非小细胞肺癌总生存时间和临床特征的关系。2体外研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药的实验2.1 CCK-8实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的IC50值。2.2蛋白质免疫印迹实验（WB）比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的蛋白表达2.3 qRT-PCR实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的mRNA水平。2.4 免疫荧光试验探讨与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib组GBP1、PCNA荧光值变化。2.5 CCK-8实验分析不同浓度厄洛替尼作用下,PC9ER-shGBP1+erlotinib组与PC9ER--NC+erlotinib 组间的 IC50值。2.6流式凋亡实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的晚期凋亡细胞占比。2.7WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组凋亡标志物Bax、Bcl-2和cleaved PARP1蛋白表达变化。2.8流式细胞周期实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的G1期占比。2.9 WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组细胞周期标志物P21、Cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达变化。第二部分体内研究1体内研究过表达GBP1实验1.1 裸鼠成瘤实验比较 PC9ER-NC+erlotinib 组和 PC9ER-shGBP1+erlotinib 组间的移植瘤大小、重量。1.2 裸鼠成瘤实验比较 PC9-NC+PBS 组、PC9-NC+erlotinib 组、PC9-GBP1+PBS组、PC9-GBP1+erlotinib组的移植瘤大小、重量。1.3 IHC实验检测小鼠肿块GBP 1、PCNA以及凋亡蛋白的表达。2体内研究过表达GBP1组GBP1的WB和qRT-PCR实验2.1 qRT-PCR 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间GBP1的mRNA水平。2.2 WB 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间 GBP 1蛋白表达变化。2.3 IHC实验检测小鼠肿块PC9-NC+erlotinib组与 PC9-GBP1+erlotinib组间 P21、Cyclin D1蛋白的蛋白表达变化。第三部分 机制探讨1 GBP1和PGK1互作的实验1.1 质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白。1.2 免疫共沉淀实验分析GBP1和PGK1的互作关系。1.3 免疫荧光实验检测GBP1和PGK1共定位关系。1.4 WB实验分析GBP1和PGK1的蛋白调控关系。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药的实验2.1 WB实验检测与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组、耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1组EMT相关蛋白的表达变化。2.2 CCK-8实验检测耐药细胞沉默PGK1组与对照组间的IC50值。2.3 qRT-PCR实验检测耐药细胞与敏感细胞间E-cadherin的mRNA水平。2.4 CCK-8实验检测耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组间的IC50值。2.5 WB实验分析PGK1和Twist的关系。2.6 IHC 实验分析了小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间的EMT相关蛋白的表达变化。第四部分 临床意义非小细胞肺癌中高表达GBP1与预后、临床数据的关系分析1 Kaplan-Meier生存分析GBP1和PGK1表达水平与总生存时间的关系。2 cBioportal数据库分析GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平的相关性。3 Oncomine数据分析非小细胞肺癌GBP1表达与临床数据的相关性。研究结果第一部分GBP1在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞中的表达及意义1 GBP1参与厄洛替尼耐药1.1与敏感细胞株相比,厄洛替尼在耐药细胞株PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975 的 IC50值升高。1.2 与敏感细胞株相比,PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975中GBP1的mRNA水平升高。1.3 Mann-Whitney检验发现高表达的GBP1与厄洛替尼耐药性增强相关。1.4 PC9ER 及 HCC827ER 中未发现 T790M 突变。1.5单因素分析与多因素分析结果表明,与总生存时间相关的因素是治疗后肿瘤情况、GBP1表达水平。2体外研究表明GBP1调控厄洛替尼耐药2.1与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1蛋白表达减低。2.2与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1的mRNA水平减低。2.3与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组的IC50值减低。2.4 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,GBP1、PCNA 在 PC9ER-shGBP1+erlotinib组有弱的荧光值。2.5在相同浓度的厄洛替尼作用下,与PC9ER-NC+erlotinib组比较,PC9ER-shGBP 1+erlotinib组的细胞存活率减低。2.6与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的晚期凋亡细胞占比增高。2.7与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1时Bcl-2和PCNA的蛋白表达减低,Bax和cleaved PARP1的蛋白表达增高。2.8与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的G1期占比增高。2.9与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的P21蛋白表达增高,Cycilin D1、CDK4和CDK6的蛋白表达减低。以上结果表明GBP1在厄洛替尼耐药细胞高表达,且提升的GBP1通过促进凋亡,增加细胞G1期比例调控厄洛替尼耐药。第二部分体内研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药1过表达GBP1促进厄洛替尼耐药性1.1 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib 组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.2与PC9-NC+erlotinib组比较,PC9-GBP1+erlotinib组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.3 与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组的 GBP1、PCNA 和 Bcl-2蛋白表达升高,而cleaved PARP1蛋白表达减低。2过表达GBP1减少细胞周期G1期占比2.1 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 的mRNA水平升高。2.2 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 蛋白表达升高。2.3 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 P21 蛋白表达减低,Cyclin D1蛋白表达增高。以上结果表明在体内研究中,过表达GBP1增加厄洛替尼耐药性,减少细胞G1期比例。第三部分GBP1和PGK1互作促进厄洛替尼耐药1 GBP1和PGK1之间存在互作1.1质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白有MYL9、ANXA2、ALDOA、PGK1等。1.2免疫共沉淀实验（CoIP）确认GBP1和PGK1的互作关系。1.3免疫荧光实验确认GBP1和PGK1的共定位关系。1.4 GBP1在蛋白水平调控PGK1蛋白表达。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药2.1耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1,能回复耐药细胞沉默GBP1对EMT相关蛋白的影响。2.2耐药细胞沉默PGK1组与对照组比较,IC50值减低。2.3耐药细胞与敏感细胞相比,E-cadherin的mRNA水平减低。2.4耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组比较,IC50值增高。2.5 PGK1促进Twist蛋白表达。2.6 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 PGK1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达增高,而E-cadherin蛋白表达减低。以上结果表明GBP1通过PGK1激活的EMT通路调控厄洛替尼耐药。第四部分GBP1表达与患者预后、病理分级的关系非小细胞肺癌中高表达GBP1与差的预后、高的肿瘤分级相关1高表达GBP1、PGK1的患者总生存时间和首次进展时间缩短。2 GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平呈正相关。3非小细胞肺癌患者的病理分级与GBP1表达呈显着正相关。以上结果表明GBP1的高表达提示非小细胞肺癌患者差的预后、高的病理分级。研究结论本研究发现在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞株中,GBP1无论蛋白表达还是mRNA水平均明显提高。而且GBP1水平提高使厄洛替尼敏感细胞在体内及体外获得对厄洛替尼的耐药性。同时上调的GBP1能减少凋亡相关蛋白的表达,并诱导细胞G1期向S期转换。GBP1和PGK1互作且通过EMT信号通路参与厄洛替尼耐药调控。利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库发现高表达GBP1提示总生存时间和首次进展时间缩短。总之,我们利用细胞株、动物模型和临床样本证明GBP1表达变化调控厄洛替尼耐药,提示在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中靶向GBP1可能是一个潜在的治疗干预靶点。
宋若飘[7]（2020）在《基于数据库分析AXL、Vimentin和E-cadherin在NSCLC中的表达及意义》文中提出目的:利用公共在线数据库癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中的非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）数据库和组织芯片探索酪氨酸激酶受体AXL、波形蛋白（Vimentin）和E-钙黏连蛋白（E-cadherin）的表达情况及其与临床病理参数和预后的关系,初步探讨AXL参与肺癌发生发展的机制,为NSCLC靶向治疗提供新思路。方法:1.下载TCGA肺鳞癌和肺腺癌数据库,筛选具有完整资料的研究对象肺鳞癌500例、肺腺癌512例,分析AXL、VIM、CDH1的基因表达情况及与临床病理参数和预后的关系。2.将TCGA肺腺癌数据库中AXL表达水平分为高、低表达两组,通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）研究AXL的表达水平影响的生物通路基因集。3.采用免疫组织化学染色方法分析非小细胞肺癌组织微阵列芯片中AXL、Vimentin和E-cadherin的蛋白表达及肺疾病谱组织微阵列芯片中AXL蛋白的表达。结果:1.分析TCGA肺鳞癌和肺腺癌数据库发现:AXL在肺鳞癌中低于正常肺组织,在肺腺癌中高于正常肺组织。通过Spearman法分析肺鳞癌和肺腺癌中各基因之间相关性发现:AXL与VIM在肺鳞癌与肺腺癌中均呈正相关（P<0.05）;VIM与CDH1在肺鳞癌与肺腺癌中均呈负相关（P<0.05）;而AXL与CDH1在肺鳞癌中呈负相关（P<0.05）,在肺腺癌中呈正相关（P<0.05）。分析AXL、VIM、CDH1联合表达与临床病理参数的关系时发现:AXL高表达联合VIM高表达、AXL高表达联合CDH1低表达以及AXL高表达、VIM高表达联合CDH1低表达促进肿瘤的临床分期进展。进行影响非小细胞肺癌预后的单因素与多因素分析显示:T分期、N分期、M分期、TNM分期、AXL表达、AXL高表达+VIM高表达、AXL高表达+CDH1低表达、AXL高表达+VIM高表达+CDH1低表达降低NSCLC患者的总生存期,并且M分期、AXL表达、AXL高表达+VIM高表达、AXL高表达+CDH1低表达、AXL高表达+VIM高表达+CDH1低表达为NSCLC的独立预后因素。此外,AXL高表达影响肺腺癌患者的总生存期,而对肺鳞癌患者的预后无明显影响。2.通过GSEA富集分析发现,AXL高表达可能通过炎症及细胞外基质等生物过程和相关通路参与肺癌进展。3.通过NSCLC组织芯片验证发现:AXL、Vimentin和E-cadherin蛋白在NSCLC中表达均高于正常肺组织。分析各蛋白之间表达的相关性发现:AXL和Vimentin呈正相关。分析AXL和Vimentin表达与临床病理参数的关系时发现,相比于无淋巴结转移,AXL在有淋巴结转移的组织中高表达。4.通过对肺疾病组织芯片验证发现,AXL蛋白在肺良性疾病表达均高于正常肺组织。结论:1.根据数据库和免疫组化分析AXL、Vimentin和E-cadherin在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理参数的关系时发现,AXL可能通过与E-cadherin相互作用维持EMT进程,从而促进肺癌的侵袭与不良预后。2.GSEA富集分析发现,AXL促进肺癌的发生发展机制涉及细胞外基质和炎症等生物过程和相关通路。3.通过分析肺良性疾病组织芯片发现,AXL蛋白在炎性疾病中高表达。
杨莎莎[8]（2020）在《FOXH1在非小细胞肺癌中的作用及其机制研究》文中研究表明背景和目的:肺癌是威胁生命健康的恶性肿瘤之一,且其发病率逐年增加。尽管肺癌的防治和发病机理研究取得了长足发展,但晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者的预后仍然很差。因此,深入研究和探索肺癌的潜在发病途径和新靶点对改善NSCLC的治疗有重要意义。FOXH1（forkheadbox H1）（也称为FAST1）是FOX转录因子家族高度保守的成员之一,是一种叉头或翼螺旋DNA结合蛋白。研究发现FOXH1的异常表达与多种癌的发生发展相关,但是FOXH1在非小细胞肺癌中的生物学功能尚不清楚。本文拟观察FOXH1在非小细胞肺癌中表达的基础之上,进一步探讨FOXH1的异常表达对非小细胞肺癌增值、侵袭、转移的影响及相关机制。研究方法:（1）FOXH1在非小细胞肺癌中的表达以及与临床病理参数的关系。首先从数据分析开始入手,通过UALCAN和TCGA（The Cancer Genome Atlas）分析FOXH1的mRNA及蛋白在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达情况。接着我们又在Kaplan-Meier Plotter在线数据库评估了 FOXH1与非小细胞肺癌患者相关的预后。应用免疫组织化学的方法检测了 94例非小细胞肺癌组织及84例正常组织中FOXH1蛋白的表达情况,并对FOXH1蛋白的表达水平与临床病理参数进行相关性分析。在此基础上,利用Western blotting的方法检测了 FOXH1蛋白在正常人支气管上皮细胞系（16HBE）、人非小细胞肺癌细胞系（A549、PC9、H460、H1299、H1957）中的表达情况。（2）FOXH1在体外对非小细胞肺癌恶性生物学行为的影响。体外构建FOXH1干扰表达慢病毒载体,构建FOXH1低表达的A549和PC9两个稳定细胞系,用CCK-8法检测FOXH1对肺癌细胞增殖能力的影响,通过流式细胞术检测FOXH1对细胞周期的影响,细胞划痕实验和Transwell实验检测FOXH1对非小细胞肺癌侵袭和迁移能力的影响,用体内成瘤的方式制备裸鼠皮下成瘤实验进一步证实FOXH1对肺癌细胞在体内增殖能力的变化。（3）FOXH1参与调控非小细胞肺癌生物学功能的分子机制研究。利用STRING（http://string-db.org）在线软件构建了 FOXH1的蛋白网络,检测了 FOXH1与EMT相关蛋白之间的联系。用Western blotting和细胞免疫荧光检测了沉默FOXH1对EMT相关的特异分子表达的影响。通过STRING数据库构建了 FOXH1与Wnt/β-catenin通路相关的蛋白网络,检测FOXH1蛋白对Wnt/β-catenin通路中β-catenin以及它下游因子p-GSK-3β和CyclinD1的表达影响。结果:（1）FOXH1 mRNA和FOXH1蛋白在非小细胞肺癌组织中明显上调,FOXH1的高表达与患者的首次进展生存率以及总生存率相关,通过临床病理参数的分析发现,非小细胞肺癌组织中FOXH1的表达水平高于癌旁组织,并且与肿瘤分级、临床分期以及淋巴结转移密切相关,FOXH1的高表达可能会促进非小细胞肺癌的发生发展。非小细胞肺癌细胞系中FOXH1的表达明显高于正常人支气管上皮样细胞系（16HBE）。（2）沉默FOXH1明显减弱A549细胞和PC9细胞的体外增殖能力、克隆形成能力,干扰FOXH1能够显着影响非小细胞肺癌周期分布,细胞阻滞在G0/G1期,从而抑制肿瘤细胞增殖,沉默FOXH1降低非小细胞肺癌的侵袭和迁移能力。裸鼠皮下成瘤实验证实了干扰FOXH1的表达降低了非小细胞肺癌细胞体内的增殖。（3）STRING在线软件构建FOXH1的蛋白网络分析发现FOXH1与MMP2、N-钙黏着蛋白（CDH2）、Snail、Slug（Snai12）,波形蛋白（Vimentin）都有着十分密切的联系。沉默FOXH1可以降低非小细胞肺癌中MMP2、波形蛋白和N-钙黏着蛋白（N-cadherin）、Snail和Slug蛋白的表达。STRING数据库蛋白网络分析发现 FOXH1 与 Wnt/β-catenin 通路以及下游因子 GSK-3β 和 CyclinDl（CCND1）的关系密切,干扰FOXH1降低非小细胞肺癌细胞β-catenin、p-GSK-3β和CyclinD1的表达。结论:（1）FOXH1蛋白在人非小细胞肺癌中呈高表达,并影响非小细胞肺癌患者预后,FOXH1与患者的肿瘤分级、临床分期以及淋巴结转移密切相关。（2）FOXH1可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和EMT等生物学功能,FOXH1有望成为非小细胞肺癌治疗靶点。
栗家平[9]（2020）在《SALL4在非小细胞肺癌中表达的临床意义及作用分子机制的研究》文中认为目的:肺癌是临床上常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在我国均居恶性肿瘤的首位,肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占85%以上。目前肺癌的传统治疗方式包括手术切除、放疗和化疗等,但对于晚期肺癌患者,由于癌细胞发生转移、化疗敏感性低等因素,使得其治疗效果并不理想,五年生存率较低。肺癌的发生是一个涉及多种癌基因的异常表达及抑癌基因失活的过程,近年来,根据肺癌患者特定基因突变类型而进行的分子靶向治疗取得了巨大进展,并在一定程度上提高了肺癌患者的生存周期。因此,探究肺癌发生、转移的分子机制,为肺癌的临床治疗提供新的思路和干预靶标,对提高肺癌临床疗效具有重要意义。人类婆罗双树样基因（SALL4）是近年来发现的一种原癌基因,其编码一种锌指蛋白转录因子,在维持胚胎干细胞的自我更新和多能性方面发挥重要作用。SALL4可通过调节不同的信号通路、转录因子和表观遗传修饰等机制发挥其调控功能,参与了多种恶性肿瘤如肝癌、胃癌的发生和进展过程,且其表达水平影响肿瘤患者的预后。目前关于SALL4在肺癌中的调控作用和临床意义尚不多见,因此本研究旨在探讨SALL4在肺癌中的表达,分析SALL4表达水平与肺癌患者临床病理参数和预后的相关性,进而从细胞水平探讨SALL4对肺癌细胞生物学功能的调控作用及其可能的作用机制。方法:（1）采用RT-PCR检测30例肺腺癌患者肿瘤组织中SALL4 mRNA的表达水平,免疫组化（肺癌组织芯片,62例）检测肿瘤组织中SALL4表达并对染色结果进行评分,收集患者完整的临床资料,分析SALL4表达与患者各临床病理参数的相关性。根据回访情况绘制Kaplan-Meier生存曲线,分析SALL4表达对患者总生存周期和无病生存周期的影响,单因素和多因素回归分析SALL4表达对于预后判断的临床意义。（2）采用RT-PCR及Western blot法检测5种肺癌细胞系中S ALL4 mRNA和蛋白的表达水平,构建稳定敲低SALL4表达的肺癌细胞系,采用平板克隆形成实验和MTT法检测SALL4对肺癌细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测SALL4对肺癌细胞的细胞周期和细胞凋亡情况的影响,并采用Western blot检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白的表达。细胞划痕实验检测各组肺癌细胞的迁移情况,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测肺癌细胞EMT相关蛋白的表达。进而建立肺癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察在体内敲低SALL4表达对移植瘤生长的影响,并采用Western blot检测瘤体中相关蛋白的表达水平。（3）Western blot法检测转染后肺癌细胞中STAT3的表达及其磷酸化水平,在敲低表达SALL4的细胞中激活STAT3的表达,采用MTT法、流式细胞术和Transwell法检测共转染siRNA-SALL4和激活STAT3后细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化。结果:（1）SALL4的表达（mRNA）在30例肺癌肿瘤组织显着高于癌旁正常组织（P<0.05）。免疫组化（肺癌组织芯片:62例）结果显示,SALL4在肿瘤组织中的阳性率为67.7%（42/62）,而在癌旁正常组织SALL4表达的阳性率为19.4%（12/62）（P<0.05）,表明SALL4在肺癌组织中表达上调。临床病理资料分析结果显示,SALL4表达与患者TNM分期和淋巴结转移密切相关（P<0.05）,而与患者性别、年龄、吸烟状况、肿瘤大小和分化程度无显着相关性（P>0.05）,其中SALL4高表达组相比于SALL4低表达组具有更多的淋巴结转移例数和更高的TNM分期。预后分析结果显示,SALL4低表达者相比于SALL4高表达者具有更长的总生存期和无病生存期,且SALL4表达是肺癌患者预后的独立危险因子。（2）SALL4 mRNA和蛋白表达在肺癌细胞系中显着上调,与组织中表达情况一致。在A549和H358细胞系中构建稳定敲低SALL4表达的肺癌细胞系,RT-PCR结果显示转染siRNA-SALL4后,A549和H358细胞中SALL4的表达水平显着降低（P<0.05）,表明转染成功。平板克隆实验结果显示,抑制SALL4表达后,克隆形成数显着下降（P<0.05）;MTT结果显示,siRNA-SALL4组细胞从第2天开始生长活性显着低于对照组（P<0.05）,表明敲低SALL4可抑制肺癌细胞的增殖能力。流式细胞实验结果显示,抑制SALL4表达后,肺癌细胞发生凋亡的比例显着升高（P<0.05）,且可将肺癌细胞阻滞在G0/G1期,从而抑制细胞周期的进展。细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,抑制SALL4表达,肺癌细胞的迁移和侵袭能力均显着降低（P<0.05）。Western blot实验结果显示,抑制SALL4表达,肺癌细胞中Bax、Caspase3和Caspase9蛋白的表达增强,而Bcl-2蛋白表达减弱,同样,细胞周期相关蛋白CyclinB,CyclinE和Cyclin D1的表达也显着降低,且细胞EMT过程得到抑制。动物实验结果显示,敲低SALL4表达后,移植瘤体积和重量的增长速度均显着降低,即在体内水平降低SALL4表达可抑制肺癌移植瘤的生长;（3）Westernblot结果显示,敲低SALL4表达后,磷酸化p-STAT3的表达水平均显着下降,表明敲低SALL4可同时抑制STAT3的磷酸化过程。在转染siRNA-SALL4和激活STAT3后,si-SALL4+激活STAT3组肺癌细胞相比于siRNA-SALL4组的生长活性和侵袭能力显着增强,而凋亡能力显着减弱,表明激活STAT3可逆转敲低SALL4对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。结论:SALL4在肺癌组织和细胞系中表达均上调,其表达与患者TNM分期、淋巴结转移和预后明显相关;敲低SALL4表达可显着降低肺癌细胞的增殖活性、迁移和侵袭能力及EMT过程,并阻滞细胞周期进展,促进细胞凋亡,其可能机制与SALL4可靶向激活STAT3信号通路有关。本研究为明确肺癌发生发展的分子机制提供了新的思路,并为寻找新的肺癌诊治的作用靶点提供理论基础。
李广斌[10]（2020）在《EDDM3A下调MTA3表达促进NSCLC细胞EMT和侵袭迁移的作用及机制研究》文中研究表明背景和意义:原发性肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,在我国发病率极高。在未来几十年中,肺癌仍将是我国癌症防治工作的重要内容。由于肺癌的潜伏期较长,恶性程度高,多数患者发现确诊时已出现转移,错过了最佳的治疗机会。因此,肺癌的发生发展及转移的相关机制研究,对改善肺癌的治疗效果和预后具有重要意义。肿瘤转移是患者的主要死因之一,研究发现恶性肿瘤的转移与上皮间质转化的发生密切相关。MTA3可以抑制Snail的表达,而Snail作为转录因子可以抑制上皮细胞标志物E-cadherin的转录和活性,促进上皮间质转化发生,导致细胞极性消失,黏附力下降,迁移、扩散能力增强。EDDM3A是一种位于14q11.2的蛋白编辑基因,近些年来,越来越多的证据表明14q11.2位点与多种肿瘤性疾病的发生发展有关。然而,关于EDDM3A在促进肺癌发生发展和侵袭转移机制的研究未见相关报道。我们推测EDDM3A可能是通过下调MTA3表达,从而发挥作用。因此,本实验通过对癌症数据库、肺癌组织标本和细胞株的EDDM3A表达情况分别进行检测,并对EDDM3A和肺癌发生发展的相关性进行分析验证,最后对EDDM3A促进肺癌转移的机制进行初步探索,以期为改善肺癌的治疗效果和预后提供新的思路。本研究分为以下三部分进行。研究方法:一、非小细胞肺癌中EDDM3A的表达及临床意义。在癌症基因组图谱（TCGA）的数据库进行筛选,检测EDDM3A在非小细胞肺癌与癌旁正常肺组织中的表达水平。对我科肺癌组织标本进行EDDM3A蛋白免疫组化染色,分析EDDM3A表达水平与临床病理特征之间的关系。二、EDDM3A促进非小细胞肺癌的发生发展。分别选取人肺腺癌细胞A549和95D为目的细胞,使用慢病毒介导的shRNA干扰EDDM3A,通过实时定量PCR和免疫印迹试验来检测EDDM3A的表达水平。检测EDDM3A基因消减对细胞增殖、细胞凋亡和克隆形成能力的影响。三、EDDM3A下调MTA3促进非小细胞肺癌EMT和侵袭转移。为了进一步探索EDDM3A在NSCLC发生发展中的作用机制,我们通过下调及上调NSCLC细胞系中EDDM3A的表达水平来检测对细胞迁移的影响。通过Transwell迁移和Matrigel侵袭实验来证实EDDM3A在调节A549和H1299细胞的运动侵袭能力中的作用。分别在A549细胞中下调EDDM3A和在H1299细胞中上调EDDM3A,通过Western blot检测MTA3蛋白表达水平的变化。结果:一、在TCGA数据库中,选取肺腺癌作为关键词,筛选出有成对（癌和癌旁）RNA-seq数据且有病理信息的样本数共57个,从中筛选出目的基因:EDDM3A。EDDM3A在癌组织中的表达水平高于癌旁组织。选取我科肺癌组织标本行EDDM3A蛋白检测,结果相同,且EDDM3A蛋白表达水平与TNM分期密切相关,高表达的患者肿瘤恶性程度高,肿瘤体积更大,更易出现淋巴结转移和远处转移,临床分期更差。二、使用慢病毒介导的shRNA干扰肺癌细胞系中EDDM3A基因后,EDDM3A表达在mRNA水平和蛋白质水平的表达量均受到显着抑制,同时两种细胞的增殖速率受到显着抑制,凋亡显着增加,细胞克隆能力下降。三、为了进一步探索EDDM3A在NSCLC发生发展中的作用,我们通过下调EDDM3A表达可以抑制A549细胞系的迁移能力。相反,上调EDDM3A表达可以促进H1299细胞迁移。显微形态观察发现,下调EDDM3A表达可诱导具有间质细胞形态的H446细胞向上皮细胞形态转变,而过表达EDDM3A则诱导SPC-A1细胞由上皮细胞形状向间质细胞形状转变。此外,Western blot实验发现,在A549细胞中下调EDDM3A能够显着增强MTA3蛋白的表达;相反,在H1299细胞中上调EDDM3A能够显着抑制MTA3蛋白的表达。结论:一、EDDM3A在非小细胞肺癌中高表达,且表达升高与肺癌细胞分化差、分期更晚相关。因此提示EDDM3A分子可以作为在肺癌中判断分期和转移的一个指标。二、下调肺癌细胞系中EDDM3A的表达水平,可以显着抑制细胞的增殖,促进凋亡。说明EDDM3A在NSCLC的发生发展中起到重要作用。三、上调肺癌细胞系中EDDM3A的表达可以促进细胞侵袭、迁移和EMT发生,而下调EDDM3A表达可以抑制上述细胞功能。EDDM3A促非小细胞肺癌发生发展和EMT发生,是通过抑制MTA3,进而激活Snail来实现的。这些结果为NSCLC的转移机制提供新的理论,从而为NSCLC临床诊治提供新的干预途径。
二、E-cadherin在非小细胞肺癌中的表达及临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E-cadherin在非小细胞肺癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
（1）非小细胞肺癌中E-cadherin基因甲基化及蛋白表达的研究（论文提纲范文）
| 1 资料和方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标本的收集与处理 |
| 1.2.2 组织免疫组化检测E-cadherin蛋白方法 |
| 1.2.3 E-cadherin基因甲基化检测方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 E-cadherin蛋白表达：癌旁组织和肺癌组织的指标比较 |
| 2.2 癌旁组织与癌组织E-cadherin基因甲基化比较 |
| 2.3 肺癌患者E-cadherin蛋白表达与E-cadherin基因甲基化状态的相关性分析 |
| 3 讨论 |
（2）Galectin-4与K-Ras结合影响其下游通路激活参与非小细胞肺癌转移的调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1.Galectin-4在肿瘤转移中的作用及其机制的研究进展 |
| 2.K-Ras在非小细胞肺癌的发生发展中的作用 |
| 2.1 K-Ras在非小细胞肺癌中的表达及可能的靶点性质 |
| 2.2 K-Ras在细胞内介导的信号通路及相关机制 |
| 2.3 K-Ras参与非小细胞肺癌转移 |
| 2.4 靶向K-Ras的非小细胞肺癌的治疗策略 |
| 3.EGFR在非小细胞肺癌转移中的作用 |
| 4.肿瘤细胞的上皮-间质转化过程 |
| 5.本课题的研究方向 |
| 实验部分 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 化合物 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 试剂 |
| 1.3.1 细胞培养试剂 |
| 1.3.2 细胞转染试剂 |
| 1.3.3 电泳和Western blot检测试剂 |
| 1.3.4 免疫共沉淀检测试剂 |
| 1.3.5 免疫荧光检测试剂 |
| 1.3.6 Transwell实验试剂 |
| 1.3.7 PCR实验试剂 |
| 1.3.8 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 体外实验 |
| 2.1.1 细胞培养实验 |
| 2.1.2 siRNA和质粒转染实验 |
| 2.1.3 划痕法迁移实验 |
| 2.1.4 Transwell实验 |
| 2.1.5 Western blot实验 |
| 2.1.6 免疫荧光实验 |
| 2.1.7 免疫共沉淀实验 |
| 2.1.8 PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)分析 |
| 2.1.9 蛋白分子模拟对接实验 |
| 2.2 体内实验 |
| 2.2.1 动物饲养 |
| 2.2.2 裸鼠体内肺癌转移实验 |
| 2.2.3 裸鼠肺组织切片免疫荧光 |
| 2.2.4 裸鼠肺组织PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)分析 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Gal-4对K-Ras的直接调节作用 |
| 3.1.1 A549,H460,H1299,Calu-1细胞内gal-4,K-Ras,EGFR的表达水平 |
| 3.1.2 NSCLC细胞K-Ras基因型检测 |
| 3.1.3 NSCLC细胞转染siRNA和过表达质粒后分别降低或升高细胞内gal-4表达 |
| 3.1.4 Gal-4抑制A549,H460细胞内K-Ras的表达,而促进H1299,Calu-1细胞内K-Ras的表达 |
| 3.1.5 Gal-4不是通过调节EGFR的激活来调节K-Ras的表达 |
| 3.1.6 Gal-4抑制K-Ras在A549和H460细胞中的细胞膜锚定,而促进K-Ras在H1299和Calu-1细胞中向细胞膜定位 |
| 3.1.7 Gal-4的表达促进K-Ras突变型细胞中K-Ras/gal-4异聚体的形成,而抑制野生型细胞中异聚体的形成 |
| 3.2 Gal-4通过调节K-Ras下游通路来调节NSCLC细胞的侵袭迁移能力 |
| 3.2.1 Gal-4可下调A549和H460细胞内的K-Ras下游通路蛋白表达,而上调H1299和Calu-1细胞内K-Ras下游通路蛋白的表达 |
| 3.2.2 Gal-4通过K-Ras/JNK/c-Jun通路来调节四种细胞的侵袭迁移 |
| 3.2.2.1 Gal-4抑制A549和H460细胞中的p-c-Jun入核,而促进H1299和Calu-1细胞的p-c-Jun入核 |
| 3.2.2.2 K-Ras/JNK/c-Jun通路激活可促进NSCLC细胞的侵袭、迁移 |
| 3.2.2.3 细胞内gal-4调控K-Ras/JNK/c-Jun的表达与激活来调控NSCLC细胞的侵袭和迁移 |
| 3.2.3 Gal-4通过调节K-Ras/c-raf/MEK/ERK通路来发挥对非小细胞肺癌侵袭转移的相反调节作用 |
| 3.2.3.1 Gal-4影响K-Ras/c-raf复合体的形成 |
| 3.2.3.2 K-Ras/c-raf/MEK/ERK通路激活促进NSCLC细胞的侵袭、迁移 |
| 3.2.3.3 细胞内gal-4调控K-Ras/c-raf/MEK/ERK的表达水平来调控NSCLC细胞的侵袭和迁移 |
| 3.3 细胞内gal-4抑制裸鼠体内H460细胞肺转移,促进Calu-1细胞肺转移 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表和待发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）WSB2在宣威肺癌增殖及迁移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 WSB2在宣威肺癌组织中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 在宣威肺癌细胞XWLC-05及裸鼠体内WSB2的生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 WSB2激活Wnt/β-Catenin信号通路促进宣威肺癌细胞增殖、迁移的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 WSB2及相关信号通路在肺癌中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）miR-9-5P在非小细胞肺癌和血管生成拟态中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分: 人NSCLC组织中miR-9-5P的表达和血管生成拟态形成情况及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分: miR-9-5P对NSCLC细胞系生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分: miR-9-5P在NSCLC和血管生成拟态形成中的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分: miR-9-5P对裸鼠NSCLC移植瘤和移植瘤中血管生成拟态形成的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 miRNAS调节血管生成拟态在肺癌转移中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）ARHGAP10在非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略表语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 ARHGAP10在非小细胞肺癌中表达及其对细胞恶性生物学行为的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 第二部分 ARHGAP10在非小细胞肺癌EMT中作用的研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 第三部分 ARHGAP10参与非小细胞肺癌EMT进程与肿瘤发生机制的研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Rho GTP酶激活蛋白在非小细胞肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）GBP1通过PGK1激活EMT通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 GBP1在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞中的表达及意义 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 结论与讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 体内研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 GBP1和PGK1互作促进厄洛替尼耐药 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 临床研究表明高表达GBP1患者预后差 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 资料与方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）基于数据库分析AXL、Vimentin和E-cadherin在NSCLC中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 AXL、Vimentin和 E-cadherin的基因在非小细胞肺癌中的表达及意义 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.1.1 TCGA数据库分析 |
| 1.1.2 GSEA |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 E-cadherin、Vimentin、AXL的基因在非小细胞肺癌的表达水平 |
| 1.2.2 E-cadherin、Vimentin、AXL的基因在非小细胞肺癌中表达与临床病理参数的关系 |
| 1.2.3 E-cadherin、Vimentin、AXL的基因在非小细胞肺癌中的表达的相关性 |
| 1.2.4 E-cadherin、Vimentin、AXL的基因表达与总生存期的关系 |
| 1.2.5 AXL高表达的GSEA |
| 第二章 组织芯片中AXL、Vimentin和 E-cadherin的蛋白在非小细胞肺癌中的表达情况 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 标本来源 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要试剂的配置 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学染色法 |
| 2.2.2 免疫组化结果判定 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 E-cadherin、Vimentin、AXL的蛋白在非小细胞肺癌的表达水平.. |
| 2.3.1.1 E-cadherin蛋白在非小细胞肺癌的表达水平 |
| 2.3.1.2 Vimentin蛋白在非小细胞肺癌的表达水平 |
| 2.3.1.3 AXL蛋白在非小细胞肺癌的表达水平 |
| 2.3.2 E-cadherin、Vimentin、AXL的蛋白在非小细胞肺癌中的表达与临床病理参数的关系 |
| 2.3.3 E-cadherin、Vimentin、AXL的蛋白在非小细胞肺癌中的表达的相关性 |
| 第三章 组织芯片检测AXL蛋白在肺良性疾病组织中的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 标本来源 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要试剂的配置 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 实验方法及统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AXL在正常肺组织及肺良性疾病组织中的表达情况 |
| 3.3.2 AXL在不同肺良性疾病组织中表达情况对比 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 TAM 在肿瘤细胞及肿瘤微环境中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）FOXH1在非小细胞肺癌中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 肺癌组织中FOXH1的表达及临床意义 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 第二部分 沉默FOXH1对肺癌细胞生长增殖的影响 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 第三部分 FOXH1通过Wnt/β-catenin调控EMT并促进肺癌细胞的侵袭和转移 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录：攻读博士期间发表论文 |
（9）SALL4在非小细胞肺癌中表达的临床意义及作用分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 SALL4在肺癌中表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 SALL4对NSCLC细胞生物学功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 SALL4调控NSCLC细胞生物学功能分子机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 SALL4在恶性肿瘤中调控作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（10）EDDM3A下调MTA3表达促进NSCLC细胞EMT和侵袭迁移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 非小细胞肺癌中EDDM3A的表达及临床意义 |
| 一、TCGA数据库中EDDM3A在非小细胞肺癌的表达情况 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 二、我科30例非小细胞肺癌病例中EDDM3A蛋白的表达情况及其与临床相关性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 EDDM3A对非小细胞肺癌发生发展的影响 |
| 一、NSCLC细胞系的培养 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二、RNAi慢病毒克隆的制备 |
| 1. 材料 |
| 2 方法 |
| 三、慢病毒包装与质量检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 四、转染 |
| 1 材料 |
| 2 实验步骤 |
| 五、Celigo细胞计数检测细胞生长 |
| 1 材料 |
| 2 实验步骤 |
| 六、MTT实验 |
| 1 材料 |
| 2 实验步骤 |
| 七、克隆形成实验 |
| 八、细胞凋亡实验 |
| 1 材料 |
| 2 实验步骤 |
| 3 数据统计与结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 EDDM3A下调MTA3促进非小细胞肺EMT和侵袭迁移 |
| 一、EMT相关蛋白的检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二、Transwell迁移实验 |
| 1 材料 |
| 2 实验步骤 |
| 三、Matrigel侵袭实验 |
| 1 材料 |
| 2 实验步骤 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 EDDM3A、EMT及肺癌诊疗进展的研究 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
四、E-cadherin在非小细胞肺癌中的表达及临床意义（论文参考文献）
- [1]非小细胞肺癌中E-cadherin基因甲基化及蛋白表达的研究[J]. 章金强,潘朝阳,崔少庸. 江西医药, 2021(09)
- [2]Galectin-4与K-Ras结合影响其下游通路激活参与非小细胞肺癌转移的调控机制研究[D]. 金秋阳. 山东大学, 2021(09)
- [3]WSB2在宣威肺癌增殖及迁移中的作用及机制研究[D]. 魏学强. 昆明医科大学, 2021
- [4]miR-9-5P在非小细胞肺癌和血管生成拟态中的作用研究[D]. 陈小波. 昆明医科大学, 2021
- [5]ARHGAP10在非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用及机制研究[D]. 林兰岚. 福建医科大学, 2021(02)
- [6]GBP1通过PGK1激活EMT通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的功能和机制研究[D]. 程丽芳. 南方医科大学, 2020(06)
- [7]基于数据库分析AXL、Vimentin和E-cadherin在NSCLC中的表达及意义[D]. 宋若飘. 河北大学, 2020(02)
- [8]FOXH1在非小细胞肺癌中的作用及其机制研究[D]. 杨莎莎. 延边大学, 2020(05)
- [9]SALL4在非小细胞肺癌中表达的临床意义及作用分子机制的研究[D]. 栗家平. 苏州大学, 2020(06)
- [10]EDDM3A下调MTA3表达促进NSCLC细胞EMT和侵袭迁移的作用及机制研究[D]. 李广斌. 苏州大学, 2020(06)