一、肿瘤患者体内促红细胞生成素浓度测定（论文文献综述）
吕建芳[1]（2021）在《肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究》文中研究指明目的建立SD雄性大鼠肾精亏虚模型,以骨髓造血干细胞为切入点,观察其凋亡情况,研究肾精亏虚对骨髓造血功能的影响,探讨其作用机制。观察龟鹿二仙胶对肾精亏虚骨髓抑制性贫血大鼠的治疗效果,通过其对大鼠的血象、骨髓象以及骨髓造血干细胞凋亡的影响,分析其“从肾论治”治疗肾精亏虚引起的骨髓抑制性贫血的作用机制。方法1、理论研究:系统回顾古今文献,阐述肾精、髓、血的中医理论研究及现代医学研究,立足肾精、髓以及血之间的关系,为肾精亏虚导致贫血提供中医理论依据。剖析龟鹿二仙胶的组方以及总结补肾填精法的现代医学临床应用。2、动物实验:SD雄性大鼠30只,SPF级,8周龄,体重270±20g,随机分为空白组、模型组、补肾组,每组10只。采用模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓以及长期小剂量苯皮下注射和短期大剂量环磷酰胺腹腔注射,建立肾精亏虚大鼠模型。整个造模过程用时49天。前4周模型组和补肾组大鼠按体质量皮下隔天注射苯（lm L/kg）,第25d开始用环磷酰胺（25mg/kg）腹腔注射,连续注射3d,同时每天用仿地震平台模拟地震振动（2次/日,共15-20分钟）以及光电刺激箱足底电击刺激（每日不定时1-3次）。空白组正常喂养。在第4周最后一天随机抽取模型组和补肾组各1只大鼠查外周血象及血清睾酮,检测模型是否成功。第29天开始,补肾组用龟鹿二仙胶灌胃,根据大鼠与人体表面积折算剂量比值,灌胃剂量为11g/Kg,分两次灌胃。给药期间每隔一天称重,根据体重调整给药剂量,连续21天。模型组和空白组大鼠给予等量去离子水灌胃,连续21天。造模过程中,每天观察各组大鼠的皮毛、进食量、活动状态等一般情况。造模结束后,每组大鼠通过眼内眦静脉取血法测外周静脉血红细胞（RBC）和血红蛋白（HGB）,观察其贫血程度;采用ELISA检测血清睾酮T以及用精子分析仪检测附睾精子质量,评价其生殖功能;取睾丸组织包埋切片,HE染色,观察其形态学的改变;分离胫骨,取新鲜骨髓,用PBS制备单细胞悬液,采用血红细胞计数板计数单核细胞数;取新鲜骨髓,制成骨髓涂片,瑞氏-吉姆萨染色,观察骨髓细胞的形态学改变;股骨包埋、切片,HE染色,观察骨髓增生情况;取新鲜骨髓包埋超薄切片,观察其超微病理改变。采用ELISA法检测各组EPO的含量;用流式细胞仪以及TUNEL法检测各组大鼠骨髓组织CD34+细胞凋亡情况;采用WB法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Faslm RNA的表达水平。3、统计学处理:各组组间进行比较,所得数据均以均数±标准差（sx?）表示,采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果（1）与正常组相比,模型组大鼠出现毛发干枯、耸立不齐、进食量下降,活动度减少等现象。补肾组大鼠毛发恢复光泽、进食量增加、活动度增加,肾虚症状得到改善。（2）与空白组比较,模型组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从14d开始下降,有显着性差异（p<0.01）;与模型组比较,补肾组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从42d开始升高,有显着性差异（p<0.05）。（3）与空白组比较,模型组血清EPO含量下降,有显着性差异（P<0.01）;与模型组比较,补肾组血清EPO含量升高,有显着性差异（P<0.01）。（4）睾丸病理切片显示,空白组睾丸曲细精管被膜完整,支持细胞形态正常,曲细精管管腔内可见大量精子;模型组曲细精管生精上皮明显变薄,细胞层次杂乱,支持细胞形态断裂,曲细精管管腔内精子细胞、精子数量明显减少;补肾组曲细精管被膜完整,细胞排布紧密,生精细胞数略有减少,部分区域可见脱落的少量生精细胞,但结构清楚,层次较分明,管腔内有较多精子。（5）与空白组比较,模型组附睾精子浓度及精子活力均下降（P<0.05）;模型组血清T含量明显下降（P<0.01）;与模型组比较,补肾组附睾精子浓度及精子活力均明显升高（P<0.01）,补肾组血清T含量升高,有显着性差异（P<0.01）。（6）骨髓象显示,与空白组比较,模型组骨髓有核细胞数量减少（P<0.05）;与模型组比较补肾组骨髓有核细胞数量增加,有显着性差异（P<0.05）。骨髓涂片可见空白组骨髓造血结构完整,组织丰富;模型组骨髓增生降低,巨核细胞减少;补肾组造血网织红细胞虽增加,但仍没有恢复正常水平。骨髓病理切片显示:空白组造血细胞多且分布均匀,骨髓造血组织支架结构紧密,脂肪细胞数量少;模型组造血组织面积减少,巨核细胞少见,造血细胞数目减少,内皮细胞、脂肪细胞等非造血细胞数目增多;补肾组造血结构组织基本修复,巨核细胞增多,造血细胞增加,仍可见脂肪细胞等非造血细胞。（7）骨髓超微病理形态学检测示:空白组大鼠可见造血干细胞为圆形,单核,核大,细胞质少,可见线粒体,线粒体内膜折叠成较深的嵴。模型组大鼠造血干细胞可见线粒体数量减少,嵴变浅或消失,线粒体肿胀,可见凋亡小体。补肾组大鼠造血干细胞有核细胞增多,凋亡小体少见,线粒体的数量增多,线粒体嵴有所恢复。（8）与空白组比较,骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测发现模型组可见较多凋亡CD34+细胞的绿色荧光点,流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的数量明显增加（P<0.05）;与模型组比较,补肾组石蜡包埋切片TUNE L法检测骨髓组织绿色荧光点数量减少,流式细胞仪检测CD34+细胞凋亡的数量降低（P<0.05）。（9）WB检测大鼠胫骨骨髓新鲜组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白表达结果与空白组比较,模型组Bcl-2蛋白含量表达降低（P<0.05）,Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量表达均升高（P<0.05）。与模型组比较,补肾组Bcl-2蛋白含量表达升高（P<0.05）,Bax、caspase-3、Fa s和Fasl蛋白含量表达均减少（P<0.05）。（10）RT-PCR检测大鼠胫骨骨髓新鲜组织Bcl-2、Bax、caspase-3、Fa s和Faslm RNA含量与空白组比较,模型组Bcl-2m RNA含量降低（P<0.05）,Baxm RNA、caspase-3m RNA、Fasm RNA和Faslm RNA含量均升高（P<0.05）。与模型组比较,补肾组Bcl-2m RNA蛋白含量升高（P<0.05）,Baxm RNA、caspa se-3m RNA、Fasm RNA和Faslm RNA含量均减少（P<0.05）。结论“肾藏精,生髓,化血”,肾藏先天之精,肾气促脾胃化生水谷精微而藏之,而“精血同源”,肾精是化生血液的重要物质基础。肾精亏虚则血液化生无源而导致血虚。肾主人体发育,也主骨髓生长发育,肾精充足,则骨髓充盈,反之肾精不足,骨髓空虚。骨髓具有化生血液的作用,髓化生血液主要取决于肾的功能,肾精亏虚则会导致骨髓功能低下,化生血液出现障碍而致血虚。本课题基于中医“肾藏精、精生髓,髓生血,精化血”理论,以肾精亏虚则会导致血虚为实验的病理依据,以造血干细胞作为切入点。研究肾精亏虚对造血功能的影响及其作用机制。以“恐伤肾”传统病因造模结合药物干预病理造模,采用模拟地震平台复合光电刺激法结合长期小剂量的苯和短期大剂量的环磷酰胺药物干预,建立肾精亏虚大鼠模型。大鼠出现肾虚症状,血液检查可以看到血红细胞数量和血红蛋白含量降低,血清EPO含量下降,血清睾酮含量降低。骨髓象可以见到骨髓有核细胞数量减少,骨髓造血组织结构疏松、造血面积减少、造血细胞减少。超微病理形态学可以观察到骨髓造血干细胞线粒体肿胀,线粒体嵴变浅,出现凋亡小体的超微病理改变。龟鹿二仙胶灌胃治疗后,能够改善肾精亏虚的症状,促进血红细胞数量和血红蛋白含量增高,血清EPO含量升高,血清睾酮含量增加,骨髓有核细胞数量增加,骨髓造血组织得到修复。骨髓造血干细胞线粒体数量增加,凋亡小体减少,减少骨髓CD34+细胞的凋亡。本实验结论归纳如下:（1）利用“仿地震平台及光电刺激+苯+环磷酰胺”成功建立肾精亏虚雄性大鼠模型。（2）肾精亏虚大鼠血清EPO含量下降,骨髓组织抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白、Bcl-2m RNA含量下降,促凋亡蛋白Bax蛋白及Baxm RNA表达增加,激活了线粒体/细胞色素c通路,发生级联效应,激活Caspase-3蛋白,诱导骨髓CD34+细胞的凋亡。骨髓Fas和Fasl蛋白及Fas和Faslm RNA含量升高,激活了死亡受体途径,激活Caspase-3蛋白,诱导CD34+细胞细胞的凋亡。CD34+细胞过度凋亡,骨髓造血干细胞活性降低,可能是肾精亏虚导致骨髓抑制影响骨髓造血功能的机制之一。（3）首次采用龟鹿二仙胶治疗肾精亏虚,改善骨髓造血功能。龟鹿二仙胶能有效缓解肾精亏虚大鼠的症状,治疗骨髓抑制性贫血有效。提高血清EPO含量,促进抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达,抑制促凋亡蛋白Bax蛋白、Fas和Fasl蛋白的表达,减少Caspase-3蛋白的表达,抑制CD34+细胞的凋亡,从而保护造血干细胞。刺激骨髓造血干细胞的增殖,避免其发生过度凋亡,可能是龟鹿二仙胶发挥其疗效机制之一。（4）从生成来源和生物学功能来看,EPO可能是肾精的物质基础之一。（5）造血干细胞是肾精在细胞层次的表现形式,是“肾精化血”功能的执行者。
李海男[2]（2021）在《终末期肾脏病患者促红素低反应性相关因素研究》文中进行了进一步梳理研究目的慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）因知晓率低、病程长、并发症多以及病死率高等特点,业已成为全球性的严重公共卫生问题。肾性贫血（Renal anemia,RA）是慢性肾脏病病程中的常见并发症,可加速肾脏疾病的进展,并显着增加患者的心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）发生率及病死率。在临床上治疗肾性贫血的手段是皮下注射促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）,但5-10%的患者对促红素的反应性低下,无法达到相应的血红蛋白（Hemoglobin,Hb）水平。通过对终末期肾病（End stage renal disease,ESRD）患者促红素低反应性的原因进行分析,为未来临床肾性贫血治疗提供新思路。提高促红细胞生成素的使用效果可以通过提高血红蛋白水平从而降低输血要求,改善肾脏功能、提高患者生活质量。确定促红素低反应的原因使优化贫血管理成为可能,从而降低医疗成本,提高贫血治疗的安全性。研究方法选择终末期肾脏病患者137例,并设置65例健康体检者作为对照组。应用酶联免疫吸附法（ELISA法）测定实验组和对照组研究对象血清中晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products,AGEs）、晚期糖基化终末产物受体（Recetor for advanced glycation end products,RAGE）、促红素抗体（Anti-erythropoietin antibody,EPO-Ab）和促红素受体（Erythropoietin receptor,EPOR）的水平。同时收集各研究对象的实验室各参数（基本情况、血液指标、肾脏功能指标）。使用SPSS23.0软件进行相关数据统计学分析。研究结果1.ESRD患者血清AGEs和RAGE水平,EPO-Ab与EPOR水平均较对照组显着升高。2.未透析ESRD患者血清AGEs和RAGE水平之间呈高度的正相关关系（r=0.883,（49）<0.001）,RAGE的水平随着AGEs的水平增加而升高。3.AGEs水平在血液透析组与未透析组间无差异,但两组水平均高于腹膜透析组。腹膜透析组与对照组的RAGE水平均显着低于血液透析组和未透析组,且血液透析组RAGE水平低于未透析组。4.未透析ESRD患者血清AGEs及RAGE水平均与肾小球滤过率呈显着负相关关系（r=-0.666,（49）<0.001;r=-0.689,（49）<0.001）。5.未透析ESRD患者血清AGEs及RAGE水平与血清肌酐之间呈显着正相关（r=0.758,（49）<0.001;r=0.707,（49）<0.001）。6.ESRD患者AGEs及RAGE与超敏C-反应蛋白之间呈显着正相关关系（r=0.656,（49）<0.001;r=0.685,（49）<0.001）。7.使用促红素的ESRD患者血清促红素抗体水平并不是普遍升高的,而仅在患有纯红细胞再生障碍性贫血的患者血清中存在高滴度的抗体。8.ESRD患者血清EPOR水平显着高于对照组。ESRD患者EPOR水平与血红蛋白及血细胞比容均呈显着的负相关（r=-0.683,（49）<0.001;r=-0.566,（49）<0.001）,EPOR水平与超敏C-反应蛋白呈显着正相关关系（r=0.574,（49）<0.001）。9.AGEs诊断促红素低反应性的特异度高,RAGE诊断促红素低反应性的灵敏度高。EPOR诊断促红素低反应性的灵敏度和特异度均较高。10.超敏C-反应蛋白与可溶性EPOR为促红素低反应性的独立危险因素。研究结论1.晚期糖基化终末产物及其受体在促进终末期肾脏病炎症状态的发生发展有重要意义,并且作为炎症过程中的重要环节间接影响患者对促红细胞生成素反应性。2.高滴度的促红细胞生成素抗体仅在患有纯红细胞再生障碍性贫血患者血清中出现,并不能作为常规筛查促红素低反应的手段。3.可溶性促红细胞生成素受体在终末期肾脏病患者血清中升高,可与骨髓红系祖细胞膜表面的促红素受体竞争结合外源性促红细胞生成素,进而导致促红素低反应性。4.循环中可溶性促红素受体的升高与终末期肾病患者体内炎症因子水平相关联。5.本研究为开发新的药物阻断终末期肾脏病患者体内AGEs-RAGE通路,从而为增强促红素疗效提供了新的理论依据。
李逊佳[3]（2021）在《EPO在炎症状态下对血管钙化的影响及机制的研究》文中研究表明研究背景与目的有临床研究发现使用高剂量促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）会增加慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）患者心血管事件发生率。而血管钙化也是CKD患者发生心血管事件的重要危险因素。虽然还没有临床研究表明EPO与血管钙化有直接关系,但有体外实验证明,EPO在高剂量下能够导致血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）钙化,但其机制不清。此外,CKD患者长期处于微炎症状态,而炎症也是血管钙化的危险因素。那么在EPO诱导的血管钙化中,炎症是否能够发挥叠加或者协同效应目前也不清楚。因此,本研究的目的是探讨EPO导致血管钙化的分子调控机制以及炎症状态下EPO对血管钙化的影响。实验方法1.体外实验（1）从Sprague-Dawley（SD）大鼠胸主动脉提取原代血管平滑肌细胞,用组织块贴壁法培养。（2）用不同浓度EPO（0 U/m L,50 U/m L,150 U/m L,250 U/m L）刺激原代血管平滑肌细胞（VSMCs）。通过茜素红染色,钙盐定量,碱性磷酸酶（ALP）活性测定血管平滑肌细胞钙化水平。用DCFH-DA探针检测细胞活性氧水平。（3）选择EPO诱导钙化最佳浓度刺激VSMCs。加入活性氧清除剂NAC观察细胞钙盐沉积。通过转录组测序对EPO刺激下产生的差异表达基因进行筛选,用PCR,Western Blot验证差异基因并检测VSMCs标志蛋白SM22α和α-SMA。用DNA下拉（Pull down）,染色质免疫沉淀（Ch IP）和双荧光素酶实验证实目的基因与钙化相关蛋白的相互作用关系。用慢病毒分别敲低和过表达目标基因以验证其促钙化效应,接着在EPO刺激下敲低目标基因进行回复实验。（4）用EPO和TNF-α刺激VSMCs。通过茜素红染色,钙盐定量,碱性磷酸酶（ALP）活性测定细胞钙化水平。用DCFH-DA探针检测细胞活性氧水平。用PCR,Western Blot检测成骨相关蛋白表达以及抗钙化蛋白MGP的表达。分别用EPO,TNF-α或二者同时刺激细胞0,5,10,60分钟,用Western Blot检测pp38与p38蛋白水平。加入p38抑制剂SB203580后观察细胞的钙化情况,活性氧水平和钙化相关蛋白表达。2.体内实验将30只SD大鼠随机分为6组（每组5只）:对照组（n=5）,低剂量EPO（1000 U/kg/W）组（n=5）,中剂量EPO（1500 U/kg/W）组（n=5）,高剂量EPO（2000 U/kg/W）组（n=5）,酪蛋白组（n=5）和酪蛋白+高剂量EPO组（n=5）。EPO经腹腔注射,每周三次连续20周。10%酪蛋白隔日经皮下注射（1.2 g/kg）连续20周以建立全身慢性炎症模型。所有大鼠喂以高磷饮食（1.2%磷）。取血液标本检测炎症因子（IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-10）水平。取腹主动脉用茜素红染色检测钙化水平;用Western Blot,免疫荧光染色检测组织中成骨相关蛋白表达水平;用PCR检测组织中成骨相关蛋白m RNA表达水平。结果1.体外实验结果（1）EPO以浓度依赖的方式显着上调VSMCs钙盐沉积,ALP活性和活性氧水平。（2）与EPO组相比,EPO+NAC组细胞钙盐沉积明显减少。转录组测序结果显示与对照组相比,EPO组有88个上调基因和59个下调基因,其中与骨形成相关的基因表达显着增加,即GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN。PCR,Western Blot与免疫荧光结果显示EPO确实能上调GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN的表达并且下调SM22α和α-SMA的表达。（3）Pull down,Ch IP与双荧光素酶实验证实GATA6可以与BMP2启动子区结合并促进BMP2的转录。与对照组相比,过表达GATA6能显着升高细胞的活性氧,钙盐沉积与ALP活性;而敲低GATA6后以上指标都显着下降。与EPO组相比,在EPO刺激下敲低GATA6会显着下调细胞活性氧,钙盐沉积与ALP活性。（4）与对照组相比,EPO组和TNF-α组中钙盐沉积,活性氧和GATA6,BMP2的表达显着上升,MGP显着下降;与EPO组相比,TNF-α+EPO组中钙盐沉积,活性氧和GATA6,BMP2的表达显着上升,MGP显着下降。（5）pp38/p38比值在不同时间点TNF-α和EPO+TNF-α刺激下显着上升,而在不同时间点EPO刺激下改变无统计意义。在TNF-α刺激下,不论有无EPO干预,加入p38抑制剂SB203580后与不加抑制剂组相比细胞的钙化,活性氧水平和GATA6,BMP2表达显着下降,抗钙化蛋白MGP显着升高。2.体内实验结果（1）EPO以剂量依赖的方式上调大鼠腹主动脉组织GATA6,BMP2,RUNX2,OPN和OCN的表达。高剂量EPO导致腹主动脉少量钙盐沉积。（2）与对照组相比,酪蛋白组和酪蛋白+EPO组大鼠血清IL-6,TNF-α和IL-1β显着升高,IL-10显着降低。（3）与对照组相比,酪蛋白组,EPO组和EPO+酪蛋白组钙盐沉积,GATA6和BMP2的表达显着增加;而EPO+酪蛋白组MGP表达显着下降。与EPO组相比,EPO+酪蛋白组钙盐沉积与GATA6和BMP2的表达显着增加。结论1.EPO能通过导致VSMCs表型转变,上调转录因子GATA6促进BMP2转录,上调细胞ROS水平和ALP活性而导致VSMCs钙化。2.TNF-α通过激活p38与ROS水平加重EPO诱导的VSMCs钙化。3.高剂量EPO可以导致大鼠腹主动脉钙盐沉积。炎症状态会加重EPO诱导的血管钙化。
杨欢[4]（2021）在《右归饮益精生血的作用机制及其与EPO的相关性》文中研究说明背景《素问·阴阳应象大论》曰“肾生骨髓,髓生肝”。五行之中,肾属水为母,肝属木为子,其“髓生肝”即肾精化生肝血,为母子相生关系的体现。肝藏血,肾藏精,精血可以互化,故“精血同源”。右归饮是经典的补肾益精方,具有阴阳双补、填精补血的功效。课题组假设“促红细胞生成素（EPO）可能是肾精的重要物质基础,可作为肾精的生物学标志物”,并在抗衰、健脑、健骨、改善生殖功能低下、增强免疫等方面验证了补肾益精中药改善肾精亏虚动物体质的同时逆转了EPO的降低。本课题拟研究右归饮对肾精亏虚贫血大鼠模型的改善作用及其与EPO的相关性,以期进一步验证“EPO可作为肾精的生物学标志物”的假设。本课题受到国家自然科学基金面上项目（81473549）资助。目的观察右归饮对肾精亏虚贫血大鼠模型的改善作用及其与EPO的相关性,阐释右归饮“益精生血”疗效的生物学作用机制。方法1.腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠模型的复制方法:用200 mg·kg-1的腺嘌呤悬液灌胃雄性SD大鼠连续3周后,再每隔一日灌胃持续8周以维持模型。2.模型成功判定标准:（1）肾精亏虚检测指标:检测大鼠血清中肌酐（CREA）、尿素（UREA）、尿素氮（BUN）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、甲状旁腺激素（PTH）、镁（Mg）、磷（P）、葡萄糖（Glu）、铁（Fe）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和肌酐清除率。（2）贫血检测指标:检测大鼠全血中的红细胞数目（RBC）、红细胞压积（HCT）、血红蛋白（HGB）。每只大鼠与正常组大鼠均值相比,取以上值均出现显着性差异的大鼠,作为造模成功的大鼠,纳入下一步试验。3.模型成功动物分组并均衡性检验及给药:将模型成功的大鼠随机分为模型组和右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1三个剂量组和rh EPO组。分组之后,给药之前,对各组动物的模型成功判定标准指标进行均衡性检验,统计学结果显示无显着性差异后方给予药物。第4周开始,右归饮各组每日上午灌胃相应剂量的右归饮配方颗粒液,rh EPO组三日一次皮下注射500 IU·kg-1的rh EPO,连续给药8周,同时除正常组以外,各组均每隔一日下午灌胃200 mg·kg-1腺嘌呤以维持模型。4.右归饮对肾精亏虚贫血大鼠模型的改善作用的观察指标及检测方法:（1）观察各组动物肾脏组织大体形态学,肾脏进行石蜡切片制作HE染色和Masson染色观察其组织形态学。（2）全自动血液生化仪检测血清中CREA、UREA、Mg、P、Glu、甘油三酯（TG）、碱性磷酸酶（ALP）和尿液中CREA、UREA、总蛋白（TP）的含量。（3）酶联免疫法测定血清中CRH、ACTH、CORT、T3、T4、PTH、Fe、Hepcidin、IL-1、白介素-2（IL-2）、IL-6、TNF-α的含量。（4）兽用全自动血细胞分析仪检测血液中RBC、HCT、HGB、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白浓度、白细胞数目（WBC）、单核细胞数目、单核细胞百分比、中性粒细胞数目、淋巴细胞百分比、PLT、PCT的含量。（5）免疫荧光和免疫印迹法检测肾脏中α-SMA的相对表达量。（6）免疫组化和免疫印迹法检测肾脏中TGFβ的相对表达量。（7）免疫荧光法检测肾脏中PDGFRβ的相对表达量。5.血清和肾脏中EPO含量及肾脏中EPO信号通路的检测方法:（1）酶联免疫法测定血清和肾脏中EPO的含量。（2）免疫印迹法检测肾脏中EPO相关通路中PHD2、GATA2、HIF2α、PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR、HIF1α、EPOR、JAK2、p-JAK2、STAT5、p-STAT5蛋白的相对表达量。结果1.腺嘌呤致模型组大鼠体质及肾功能显着降低。与正常组相比,模型组大鼠毛色更暗淡,精神更加萎靡不振,体重增长更缓慢,24 h尿液更加清澈,24 h尿量显着增多（P<0.01）,肾脏颜色苍白、肿大,表现为“大白肾”,肾脏指数和肾上腺指数显着升高（均P<0.01）,血清中CRH、ACTH、CORT、T3、PTH、Mg、P、ALP、Hepcidin显着升高（P<0.05）,血清中T4、Glu、TG、Fe显着降低（P<0.05）,表明模型大鼠体质降低;与正常组相比,模型组大鼠尿液中CREA、UREA、TP显着降低（P<0.01或P<0.05）,血清中CREA、UREA、BUN显着升高（P<0.05）,肌酐清除率显着降低（P<0.01）,表明模型大鼠肾功能降低。2.腺嘌呤致模型组大鼠出现显着贫血、炎症及肾纤维化。与正常组相比,模型组大鼠血液中RBC、HCT、HGB、MCV、淋巴细胞百分比显着降低（P<0.05或P<0.01）,平均红细胞血红蛋白浓度、WBC、单核细胞数目、单核细胞百分比、中性粒细胞数目显着升高（P<0.05或P<0.01）,表明模型大鼠出现贫血症状。与正常组相比,模型组大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α显着升高（P<0.01）,IL-2显着降低（P<0.01）,表明模型大鼠出现了炎症。与正常组相比,模型组大鼠肾脏中胶原容积分数显着升高（P<0.01）,肾脏中TGFβ、α-SMA、PDGFRβ相对表达量显着升高（均P<0.05）,表明模型大鼠肾脏发生了纤维化。3.腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠EPO含量显着降低,EPO通路蛋白显着异常。与正常组相比,模型组大鼠血清和肾脏中EPO含量显着降低（P<0.05）;肾脏中PHD2、GATA2蛋白表达显着升高（均P<0.05）,HIF2α、p-AKT、m TOR、p-m TOR、HIF1α、JAK2、p-JAK2、STAT5、p-STAT5显着降低（P<0.05或P<0.01）。4.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的体质。与模型组相比,右归饮组大鼠的毛色、精神状态得到改善,体重增长较快,肾脏的组织形态学得到改善,肾脏指数显着降低（P<0.05）,右归饮组血清中CRH、ACTH、CORT、T3、PTH、Mg、P、ALP、Hepcidin显着降低（P<0.05或P<0.01）,Fe显着升高（P<0.05）,右归饮10 g·kg-1组、20 g·kg-1组T4显着升高（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组、40 g·kg-1组的Glu显着升高（P<0.05）,表明右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠模型的体质。5.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的肾功能。与模型组相比,右归饮10 g·kg-1组尿液中UREA显着升高（P<0.05）,右归饮40 g·kg-1组尿液中TP显着升高（P<0.01）,右归饮组血清中CREA、UREA、BUN显着降低（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组肌酐清除率显着升高（P<0.05）,表明右归饮能改善肾精亏虚贫血大鼠模型的肾功能。6.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠血常规指标。与模型组相比,右归饮10 g·kg-1组、20 g·kg-1组大鼠血液中的RBC、HCT、HGB显着升高（P<0.05或P<0.01）,右归饮20 g·kg-1组的MCV显着升高（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组的平均红细胞血红蛋白浓度显着降低（P<0.05）,右归饮10 g·kg-1组的WBC显着降低（P<0.01）,右归饮20 g·kg-1组的单核细胞数目、单核细胞百分比、中性粒细胞数目显着降低（均P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组的淋巴细胞百分比显着升高（P<0.05）。7.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的炎症指标。与模型组相比,右归饮组血清中IL-1、IL-6、TNF-α显着降低（P<0.05）,右归饮组IL-2显着升高（P<0.01）。8.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的肾脏纤维化。与模型组相比,右归饮组胶原容积分数显着降低（P<0.05）,右归饮组肾脏中的TGFβ、α-SMA、PDGFRβ相对表达量显着降低（均P<0.05）,表明右归饮可以减轻模型大鼠的肾脏纤维化程度。9.右归饮能显着逆转肾精亏虚贫血大鼠的EPO含量及信号通路异常。与模型组相比,右归饮20 g·kg-1组、40 g·kg-1组大鼠血清中EPO含量显着升高（P<0.01）,右归饮10 g·kg-1组、20 g·kg-1组、40 g·kg-1组肾脏中EPO含量显着升高（均P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组PHD2、GATA2蛋白相对表达量显着降低（P<0.05）,右归饮各组HIF2α、p-AKT、p-JAK2蛋白相对表达量显着升高（均P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组、40 g·kg-1组PI3K、HIF1α蛋白相对表达量显着升高（均P<0.05）,右归饮40 g·kg-1组m TOR蛋白表达显着升高（P<0.05）,右归饮10 g·kg-1组p-m TOR蛋白表达显着升高（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组STAT5蛋白相对表达量显着升高（P<0.05）。结论1.200 mg·kg-1腺嘌呤连续灌胃3周,间隔灌胃8周后,能成功复制肾精亏虚贫血大鼠模型。2.该模型动物血清中EPO含量和肾脏中EPO蛋白表达均显着下降,PHD2/HIF2α,PI3K/AKT/m TOR/HIF1α及JAK2/STAT5通路中蛋白含量发生显着变化,显示了肾精亏虚贫血与EPO具有显着的相关性。3.补肾益精经典名方右归饮可显着改善肾精亏虚贫血大鼠模型的肾功能、炎症、肾纤维化及血常规指标,其机制可能与升高血清中EPO、肾脏中EPO的含量,调节PHD2/HIF2α,PI3K/AKT/m TOR/HIF1α及JAK2/STAT5通路中蛋白含量有关。4.上述结果证明了补肾益精名方右归饮具有益精生血的作用,为中医理论“精血同源”提供了一个实验支撑,支持“EPO可作为肾精生物学标志物”的假设。
买丽克·吾麦尔[5]（2021）在《血清铁蛋白和促红细胞生成素在骨髓增生异常综合征的表达和临床意义》文中提出目的:探讨血清铁蛋白（serum ferritin SF）和促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）在初诊骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes,MDS）患者中的表达以及临床意义。方法:收集2013年11月至2019年12月在新疆医科大学第一附属医院初诊收治的318例MDS患者临床资料,分析SF和EPO在初诊MDS患者中表达及预后的意义。结果:（1）318例初诊MDS患者SF水平正常参考区间（0～204ng/ml）占15%,介于204～500ng/ml占40%,SF<500ng/ml占55%,SF水平介于500ng/ml～1000ng/ml占30%,大于1000ng/ml占15%。SF水平与HB浓度呈负相关,与WHO分型、IPSS分层呈正相关。MDS患者SF<500ng/ml和SF≥500ng/ml两组在EPO水平、HB浓度、骨髓原始细胞百分比、WHO分型、IPSS危险度分层的分布不同,差异有统计学意义。（2）318例初诊MDS患者EPO水平在正常参考区间（1.48～31.88）占9%,介于31.88～500mIU/ml占44%,大于500mIU/ml占47%。EPO水平与年龄、H B浓度存在负相关。MDS患者EPO<500mIU/ml和EPO≥500mIU/ml两组在SF水平、HB浓度存在差异,EPO<500mIU/ml组SF水平比EPO≥500mIU/ml组低,EPO<500mIU/ml组HB浓度比EPO≥500mIU/ml组高;两组在IPSS危险度分层分布不同,差异有统计学意义。（3）MDS重度贫血与非重度贫血患者在SF水平、EPO水平分布不同,差异有统计学意义,logistic分析表明MDS患者EPO≥500mIU/ml是发生重度贫血的影响因素;（4）318例患者,失访55例,死亡84例,中位随访时间34（4-87）个月,IPSS相对高危的患者预后较IPSS相对低危的患者预后要差,SF≧500ng/ml患者预后较SF<500ng/ml组患者预后要差,EPO<500mIU/ml和EPO≥500mIU/ml两组预后差异无统计学意义。结论:MDS患者SF水平升高可预测患者不良预后,SF、E PO水平的升高与HB浓度降低相关,可动态评估MDS患者无效造血加重程度。
郑晓敏[6]（2020）在《肾性贫血治疗药物-口服低氧诱导因子-脯氨酰羟化酶（HIF-PHD）抑制剂的筛选及候选化合物DS015的药效验证》文中研究表明肾性贫血不仅影响着患者的生活质量,还是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患者并发心血管疾病的独立危险因素,可加速CKD进展,增加患者住院率和死亡率。现有标准治疗方案红细胞生成刺激剂（Erythropoiesis stimulating agents,ESAs）+铁剂,因其使用时产生超高的血浆促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）水平会诱发高血压、心衰、中风和心梗等心血管不良反应以及这些不良反应导致的死亡率增加;加之,ESAs需要注射治疗、价格昂贵等因素,主要的治疗人群为即将透析的CKD患者和已经透析的肾衰竭患者,CKD 5期前进行ESAs治疗的患者极少。因此,肾性贫血仍有较大的临床需求未被满足。低氧诱导因子-脯氨酰羟化酶（Hypoxia inducible factor-Prolyl hydroxylase domain,HIF-PHD）抑制剂通过多种效应促进红细胞生成,包括促进内源性EPO生成、改善铁代谢和提高造血细胞对EPO的反应性等,降低了治疗肾性贫血所需的EPO水平,可避免高EPO浓度导致的心血管不良反应。此外,HIF-PHD抑制剂是小分子口服药物,服用方便、费用低,依从性好,能更广泛应用于CKD 3-4期的贫血患者。已有的试验结果也显示其有较好的治疗效果和安全性,有望能克服现有治疗方案的不足,替代现有治疗方案。目的:本课题通过建立成熟稳定的药效筛选体系,包括细胞及动物的体内外实验平台,进行HIF-PHD抑制剂临床前药效研究,筛选出在体外活性及体内药效与参比化合物Roxadutat（又名FG-4592）相当或更优的HIF-PHD抑制剂。结合药代动力学和毒理初步评价,以及化学方面的考量,确定一个候选化合物,然后对候选化合物进行全面的体内外药效学验证。内容:本课题主要包括两部分内容:第一部分是HIF-PHD抑制剂的体内外筛选评价。在本部分内容中,首先建立化合物对Hep 3B细胞EPO分泌影响实验,对合成的全新化合物进行细胞活性筛选,筛选出EPO分泌活性、细胞毒性及化合物溶解性达标的化合物进行大鼠药物代谢动力学（Pharmacokinetics,PK）评价;然后将PK参数达标的化合物在ICR小鼠中单次给药后,测试血浆EPO浓度变化,考察体内药理活性;最后对体内活性较好的化合物,结合化学方面的考量,选择部分化合物进行大鼠、犬14或28天毒理评价,筛选出候选化合物。第二部分是候选化合物DS015的体内外药效学验证。在本部分内容中,分别从体外和体内两个方面对DS015进行药效学评价。体外实验包括DS015对HIF-PHD酶的亲和力测试,对Hep 3B细胞EPO转录及分泌的影响,以及对炎症因子（TNF-α和IL-1β）抑制Hep 3B细胞分泌EPO的影响。体内实验中,分别采用健康食蟹猴和大鼠肾性贫血模型进行考察,在正常食蟹猴中评价了DS015对外周血EPO和红系指标的影响,在肾性贫血模型中,分别采用5/6肾切除、庆大霉素和顺铂诱导大鼠肾性贫血模型考察DS015的治疗作用。结果:第一部分:HIF-PHD抑制剂的体内外筛选评价。通过Hep 3B细胞EPO分泌实验,从27个化合物中筛选出了4个化合物细胞活性较好,这些化合物促进Hep 3B细胞分泌的EPO最大浓度与FG-4592相当或更好,EC50在FG-4592 EC50的3倍以内,且这部分化合物的溶解性较好,对Hep 3B细胞毒性低。再经大鼠PK测试后,化合物DS015的PK参数相对较好,其大鼠口服5 mg/kg剂量后Cmax（峰浓度）为18400 ng/m L,AUClast（0-?时刻药时曲线下面积）为38400 h*ng/m L,生物利用度（F）为81.47%,半衰期(T1/2)为4.2 h;表观分布容积(Vss)为0.234 L/kg,不倾向于分布到组织中。之后测试DS015对ICR小鼠体内EPO分泌的影响,其在36、120、360μmol/kg剂量下小鼠血浆EPO浓度为202.34±56.64、581.14±128.39、5249.80±1045.02 pg/m L（溶媒组血浆EPO为153.23±18.31 pg/m L）,有较好的剂量依赖性,与同剂量下FG-4592的EPO水平（324.43～10071.30 pg/m L）相近。另外,还对DS015进行大鼠、犬毒理考察,经过毒理试验初步评价,DS015与参比化合物FG-4592毒性表现相近,DS015大鼠28天毒理试验无明显毒性反应剂量（No Observed Adverse Effect Level,NOAEL）为25 mg/kg,FG-4592大鼠14天毒理试验NOAEL为15 mg/kg;犬14天毒理试验发现,DS015 75mg/kg剂量下毒性明显比FG-4592 50mg/kg剂量轻,最终确定将DS015作为候选化合物开展后续的药效学验证。第二部分:化合物DS015的体内外药效学验证。体外HIF-PHD酶活性测试表明,DS015在HIF-PHD1/2/3酶三个亚型上均有较强的抑制活性,对应的IC50值分别为0.11、0.42、0.043μΜ,活性略优于FG-4592,在三个酶上的选择性与FG-4592相似。在Hep 3B细胞EPO转录及分泌活性实验中,DS015可浓度依赖性的促进EPO转录和分泌,起效浓度为0.93μΜ,活性略优于FG-4592;同样在化合物对炎症因子抑制Hep 3B细胞EPO分泌影响实验中,DS015能逆转炎症因子对EPO分泌的抑制作用,起效浓度为0.93μΜ,且活性略优于FG-4592。体内实验也证实,DS015在健康动物和肾性贫血模型中均表现出较好的药效活性。健康食蟹猴中,单次给予DS015（30～60mg/kg）,可明显升高血浆EPO水平,连续给予DS015（20～80 mg/kg）四周后,可观察到外周血红系指标剂量依赖性地身高,起效剂量为20 mg/kg。大鼠肾性贫血模型的药效研究也表明,在5/6肾切除大鼠贫血模型中,DS015（8～16 mg/kg）每天给药一次,连续给药四周,可以剂量依赖性地改善模型大鼠的贫血症状,起效剂量为8mg/kg;在庆大霉素诱导大鼠贫血模型中,DS015（5～12 mg/kg）每天给药一次,连续给药两周,12mg/kg剂量下,可明显升高模型动物血红蛋白（HGB）水平;在顺铂诱导大鼠肾性贫血中,DS015（8～20 mg/kg）每周给药3次,连续给药四周,可剂量依赖性显着改善模型大鼠贫血症状,起效剂量为8 mg/kg。结论:本课题针对HIF-PHD靶点机制及肾性贫血适应症建立了一系列的体内外药效评价方法。首先通过体内外EPO活性测试、药代动力学评价和毒理试验从27个化合物中筛选出了候选化合物DS015。然后对DS015进行全面的体内外药效学验证,体外酶学和细胞活性上,DS015活性略优于FG-4592,体内肾性贫血模型治疗实验表明,DS015每天给药1次和每周给药3次均可达到较好的治疗效果,起效剂量为8 mg/kg,具有较好的开发潜力。
王华宇[7]（2020）在《补肾生髓方治疗CKD3-4期rHuEPO抵抗肾性贫血的临床观察》文中研究指明目的:观察补肾生髓方治疗CKD3-4期促红细胞生成素抵抗肾性贫血肾虚髓空型的临床疗效。方法:筛选2019年3月—2019年12月黑龙江中医药大学附属第一医院肾病科门诊患者,选取符合慢性肾脏病3—4期肾性合并贫血促红素抵抗者,且中医辨证属于肾虚髓空的患者60例。完善患者初始时各项理化指标,给予补肾生髓方、西医基础治疗及生活饮食控制。以4周为一个治疗疗程,共给予3个疗程的规范化系统治疗。观察患者治疗前后的红细胞计数（RBC）、血红蛋白含量（HB）、红细胞压积（Hct）、血肌酐（CREA）、血尿素氮（BUN）、胱抑素C（Cys-C）,r Hu EPO用量,中医症候总积分等,并做出治疗前后疗效评价。结果:补肾生髓方对于慢性肾脏病3—4期肾性贫血促红素抵抗的效果较好,总有效率为88.33%。与治疗前相比,患者在治疗12周后外周的血红细胞、血红蛋白,红细胞比容平均有显着的改善（P<0.01）。血肌酐、血尿素氮、肾小球滤过率平均有显着的改善（P<0.01）。r Hu EPO用量、促红细胞生成素抵抗指数（ERI）平均有显着的改善（P<0.01）。中医症候总积分明显下降（P<0.01）,治疗4周后症状有改善,治疗8周和12周后症状改善明显;治疗12周后评分基本低于治疗前的1/2,治疗效果显着。结论:1.补肾生髓方能显着改善促红细胞生成素抵抗肾性贫血患者贫血状态,提升各项贫血指标。补肾生髓方能显着提高促红细胞生成素抵抗肾性贫血患者的肾小球滤过率,保护肾功能。1.补肾生髓方能显着改善促红细胞生成素抵抗肾性贫血患者的中医临床症状及体征,提高生活质量,且未发生明显的不良反应。
章萌[8]（2020）在《促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究》文中研究说明研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种潜在的致命性血管疾病,其定义为腹主动脉局部扩张,直径大于3cm或超过正常主动脉直径50%。AAA主要累及肾动脉分支以下的腹主动脉,患者通常没有症状,即使医生查体也难以触及扩张的腹主动脉,患者常由于其他临床指征行腹部超声或CT检查时偶然发现AAA,因此早期发现极为困难。一旦发生AAA破裂,死亡率高达85%-90%,几乎是不治之症。如何发现AAA的发病原因和快速膨胀因素并进行有效的抑制,是临床医学界面临的重大难题。尽管在AAA发病机制的研究领域已取得了巨大进展,但目前尚无有效的临床预测因子或药物治疗来降低AAA的发病风险或限制其进展。当男性和女性患者的AAA内径分别大于55mm和50mm时,可实施外科矫正术或血管内介入手术,术后存活率超过95%。因此,对于预防AAA破裂,手术矫正和支架介入是唯一有效的方法,但这些操作均有创伤性和并发症。大力研发可抑制AAA发生和发展的新药,已成为AAA研究领域中的当务之急。促红细胞生成素（EPO）由165个氨基酸和4条分子量为34kd的紧密球状结构的碳水化合物侧链组成。EPO对正常红细胞的产生至关重要,主要由胎儿肝脏及成年人肾脏合成。EPO主要通过刺激造血系统中的促红细胞生成素受体（EPOR）起到促进红细胞生成的作用。EPO可在缺氧时由肾小管间质细胞产生,通过促进红细胞生成和抑制红细胞祖细胞的凋亡而增加红细胞数量。此外,EPO潜在的造血外功能也备受关注。研究表明,EPO可由肾脏以外组织产生,且EPORs在红系祖细胞以外的其他组织中亦有广泛分布。肾脏以外产生的EPO是通过旁分泌/自分泌的途径而发挥作用,而非造血功能中的激素样作用。在创伤和炎症反应中,EPO及其受体表达明显增加,从而触发创伤组织和器官中的关键保护反应。EPO的组织保护作用已在多个动物的疾病模型中得到证实,包括局灶性脑缺血、栓塞性卒中、创伤性脑损伤、心肌缺血、急性肾损伤、肢体缺血、组织创伤等。临床研究表明,在严重创伤患者中给予EPO治疗可降低患者的死亡率。最近的研究发现,EPO可通过促进内皮细胞增殖迁移和基质金属蛋白酶2（MMP2）表达促进血管新生。接受腹主动脉腔内修复的AAA患者有三分之一患有贫血,其血红蛋白水平与AAA的大小呈独立负相关,但其机制并不明确。最近一项高脂血症小鼠中输注血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）的实验研究发现,抑制缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）减弱了 AAA的进展。众所周知,慢性贫血和HIF可增加EPO的生成,而最近的证据表明,Ang Ⅱ可直接刺激造血祖细胞的受体或间接调节EPO的基因表达来影响造血功能。有罕见病例报道,一位长期进行血液透析并应用重组人EPO治疗的患者,无明显原因地对重组人EPO产生了耐药性,并CT检测发现了 AAA。这些临床和实验研究强烈提示EPO和AAA之间可能存在着某种联系,主动脉壁新生血管的形成,也被称为血管新生,是实验和临床AAAs的病理标志。有证据表明,主动脉瘤管壁内的血管新生可能在动脉瘤的进展和破裂中起关键作用。在人动脉瘤组织中,尤其是在邻近破裂区域和被白细胞浸润的区域,血管新生更为普遍。抑制实验性AAA进展的药物,也会减少动脉壁血管新生。基质金属蛋白酶（MMPs）家族密切参与新血管形成的过程,并发挥关键的促血管生成作用,而MMPs与动脉管壁的降解和破裂有关。缺氧和炎症是刺激血管新生的两个关键因素。HIF-1α及其靶基因在人类和实验性AAAs中表达增加。抑制HIF-1a治疗可以阻止实验性AAA进展,并减轻管壁白细胞浸润、血管新生和MMPs的过度表达。炎症和免疫相关疾病与血管新生相关,因为大多数白细胞能够产生一系列促血管生成因子,如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（b-FGF）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及蛋白酶,如糜蛋白酶、胰蛋白酶、MMPs。有报道称肥大细胞特异性的糜蛋白酶和胰蛋白酶诱导内皮细胞（ECs）表达粘附分子和趋化因子,其利用趋化因子受体2（CCR2）作为募集趋化因子的受体,降解基质蛋白,促进血管新生,诱导平滑肌细胞凋亡。AAA发生和发展过程涉及了多种病理过程,比如血管新生、炎症浸润、氧化应激和平滑肌细胞凋亡等,在本研究中,我们提出如下科学假说,在ApoE-/-小鼠或野生型小鼠中,EPO可以剂量依赖性地导致AAA的发生,并且EPO通过促进血管新生,增加炎症浸润,诱导平滑肌凋亡,导致AAA的发生,为了验证这一假说,我们精心设计并进行了一系列的体内外实验。研究目的1.探讨EPO是否可在ApoE-/-小鼠和野生型小鼠中导致AAA的产生及其剂量效应;2.探讨EPO对小鼠AAA的影响是否受高脂喂养和高脂血症的影响;3.探讨EPO通过何种类型受体发挥作用对AAA产生影响;4.探讨EPO引起小鼠AAA的病理生理机制;5.探讨EPO对血管壁三种细胞（内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞）的作用及其机制。6.探讨在AAA临床患者中,血清EPO与AAA的发生有无关联。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（2）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（4）雌性APoE-/-小鼠30只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为2组,每组15只;雌性野生型小鼠30只,全程给予普通饲料喂养,随机分为2组,每组15只;分别给予生理盐水和EPO5,000IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（5）雄性ApoE-/-小鼠45只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为3组,每组15只;雄性野生型小鼠45只,全程给予普通饲料喂养,随机分为3组,每组15只;分别给予生理盐水、焦谷氨酸螺旋B表面肽（pHBSP）30 mg/kg/day和pHBSP 300mg/kg/day持续泵入,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（6）雄性ApoE-/-小鼠或野生型小鼠各30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续泵入,实验组给予Ang Ⅱ（1.44mg/kg/day）持续泵入,全程给予高脂高胆固醇喂养或普通饲料喂养,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。2.鼠尾血压测量应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。3.组织取材小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。4.血脂血常规、肝肾功检测检测各组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮的水平;检测各组小鼠全血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积。5.血管组织全基因组测序分析接受EPO中剂量注射的ApoE-/-小鼠3只,正常对照组3只,取出其主动脉组织,加入RNAlater液氮速冻,送至北京诺禾致源生物科技有限公司进行RNA测序。6.病理学检测腹主动脉组织或肝肾组织制备石蜡切片,主要进行H&E染色、Verhoff弹力纤维染色和 Masson 染色。对 Endomucin、MMP2、MMP9、MT1-MMP、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α等指标进行免疫组织化学染色,对 CD68、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α、CD144 和 Ki67 等指标进行组织免疫双荧光染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2、MMP9、MT1-MMP、VEGF、TGF-β1、KDR、Tie2、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白含量。8.明胶酶谱实验配制含1%明胶的SDS-PAGE凝胶,提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,并进行BCA蛋白浓度测定。使用明胶酶谱试剂盒检测MMP2和MMP9的蛋白酶活性。9.RNA 提取、mRNA 逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2-ΔΔCT计算出cDNA的相对表达水平。10.细胞培养和信号通路（1）根据EPO浓度梯度预实验,5 IU/mL EPO刺激HUVEC 24小时,所表达的MMP2和MMP9酶活性最高,因此接下来的细胞实验选用EPO 5 IU/mL刺激24小时,作为实验组条件;（2）HUVEC、HAEC、HASMC和巨噬细胞:实验组加入5IU/mLEPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（3）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的HASMC中,刺激24小时,收集细胞和上清;（4）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的巨噬细胞中,分别刺激0、2、4、6、8和10小时,收集细胞和上清;（5）HUVEC实验组加入10mg/L pHBSP,对照组加入等体积1xPBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（6）实验分为4组:对照组加入DMSO（作为溶剂对照）,EPO组加入EPO（5 IU/mL）+DMSO,JAK2 抑制剂组加入 EPO（5 IU/mL）+TG101348（1 μM）[49,50],STAT5 抑制剂组加入 EPO（5IU/mL）+CAS285986-31-4（50μg/mL）,刺激24小时,收集细胞或者观察拍照。11.EDU细胞增殖实验使用EDU试剂盒检测HUVEC或HASMC的增殖能力。12.内皮细胞迁移实验通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验,检测HUVEC和HAEC在EPO作用下的迁移能力。13.体外小管生成实验利用低生长因子Matrigel基质胶观察HUVEC和HAEC在EPO作用下体外小管生成能力。14.主动脉环出芽实验取野生型小鼠胸主动脉段,将血管剪成长约1mm的小段,置于Matrigel基质胶中,加入相应的药物刺激,每天观察拍照,软件分析计算主动脉出芽数量和长度。15.单核-内皮细胞粘附实验将HUVEC给予EPO刺激24小时;用BCECF-AM（pH荧光探针）标记THP-1细胞悬液;取1x105/mL THP-1混悬液加入到上述HUVEC细胞培养板中,孵育至少1小时;4%多聚甲醛固定细胞。16.TUNEL细胞凋亡检测给予HASMC EPO或者EPO处理过的HUVEC上清干预,使用TUNEL试剂盒检测HASMC的凋亡情况。17.腹腔巨噬细胞的提取选取8-12周雄性野生型小鼠,提前3天给予腹腔注射6%淀粉溶液1mL;小鼠脱颈处死,撕开皮肤,充分暴露腹膜;用无菌注射器注入DMEM于腹腔中,回抽液体至新的50mL离心管中;冲洗腹腔3次,直至DMEM变澄清,得到腹腔巨噬细胞混悬液。18.体内基质胶塞血管新生实验使用高浓度Matrigel基质胶,配制基质胶与药物混合液,取0.7mL基质胶混合液,注入小鼠皮下。14天后,切除基质胶塞;4%多聚甲醛固定过夜,观察基质胶塞大体形态颜色;石蜡包埋,切片,进行常规染色和免疫组化。19.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。20.腹主动脉瘤病人血清收集我们纳入40例AAA患者,在患者住院24小时内采集血样。患有贫血、心衰、慢性呼吸系统疾病和肾功能衰竭的病人排除入组。纳入45例健康志愿者的血清作为正常对照组。21.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;P<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO剂量依赖性地诱导ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生腹腔注射高中低剂量EPO4周后,发现EPO剂量依赖的增加了小鼠AAA的发生率,腹主动脉直径明显增加;同时,小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加。EPO高剂量组诱导ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,而EPO高剂量组诱导野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ。2.EPO导致ApoE-/-小鼠和野生型小鼠腹主动脉管壁增厚弹力板断裂结果显示注射低中高剂量EPO后,动脉管壁明显增厚,弹力纤维断裂,管腔内可伴有血栓形成。3.EPO不影响ApoE-/-、鼠和野生型小鼠血压和血脂的变化EPO注射4周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组血压并无显着差异;同样,EPO注射后没有影响小鼠血脂水平变化。由此推断,EPO注射4周,对小鼠的血压和血脂无显着影响。4.EPO不影响ApoE-/-小鼠和野生型小鼠肝功和肾功的变化EPO注射四周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组的指标没有明显变化;取对照组和EPO高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行H&E染色,组织形态亦没有明显差别。由此,从药物毒理学角度推测,EPO注射4周,并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。5.高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应在全程普通饲料喂养过程中,发现EPO剂量依赖的增加了 ApoE/-小鼠AAA的发生率,且与高脂喂养模型的发生率无显着差异;同时,高脂喂养与否,EPO高剂量组小鼠的死亡率无明显统计学意义。由此得出,高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应。6.EPO可诱导雌性ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生结果显示,在中剂量EPO刺激下雌性ApoE-/-小鼠和雌性野生型小鼠均有AAA发生,但都略低于雄性小鼠发生率,这符合人类AAA发病率中,男性高于女性的特征。7.pHBSP不能剂量依赖性的诱导小鼠AAA的发生结果显示pHBSP不能诱导两种基因型的小鼠发生AAA,因此推断EPO可能通过同源二聚体受体发挥作用,导致AAA。8.AAA患者血清EPO水平明显增高两组之间在年龄、性别、肾功能和药物治疗方面没有显着差异,但吸烟者在AAA组比正常对照组更常见。通过分析显示,年龄在>65岁和≤65岁之间、男性和女性之间、吸烟者和非吸烟者之间的腹主动脉直径没有显着差异,这表明在这组患者中,AAA直径不受传统动脉粥样硬化危险因素的影响。与健康对照组相比,AAA患者的血清EPO水平显着升高,这表明该组患者分泌了更多的EPO于循环血液中。9.基因测序分析EPO对ApoE-/-小鼠主动脉组织mRNA表达谱的影响基因本体论分析发现,两组间差异基因主要富集在血管形态发生、血管新生、细胞周期和迁移、炎症反应、白细胞浸润、和细胞外基质重塑中。10.血管新生和胶原代谢参与EPO诱导AAA的过程结果显示,与对照组相比,EPO组腹主动脉管壁胶原显着减少,尤其是胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。MMPs蛋白表达和活性明显高于对照组。EPO组腹主动脉管壁微血管密度明显增加,VEGF、TGF-β1、KDR和Tie2蛋白表达明显增高。11.炎症反应参与EPO诱导AAA的过程结果显示,EPO组腹主动脉CD68阳性细胞浸润动脉壁的程度明显高于对照组。同时 ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1 和 TNF-α 等炎症因子 mRNA水平和蛋白水平表达明显多于对照组。CD68阳性细胞来源的炎症因子明显增高。MSD检测发现,血清炎症因子水平也明显高于对照组小鼠。12.EPO对小鼠红细胞、白细胞和血小板数量的影响给予小鼠EPO注射4周后,结果显示与对照组相比,EPO组红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积明显增高。而白细胞计数、单核细胞计数、淋巴细胞计数、粒细胞计数和血小板计数在两组之间无显着性差别。13.三种细胞中内皮细胞EPOR mRNA表达水平最高与平滑肌细胞和巨噬细胞相比,内皮细胞的EPOR表达最高,提示EPO可能主要以内皮细胞为靶点发挥作用。14.EPO促进内皮细胞的增殖和迁移通过EDU实验可以观察到EPO促进HUVEC增殖。通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验观察到EPO促进HUVEC和HAEC迁移。15.EPO促进内皮细胞体外小管形成和小鼠主动脉环出芽结果显示EPO组内皮细胞更容易形成闭合的管状结构。小鼠胸主动脉环种植于Matrigel基质胶中,在EPO刺激下,主动脉环比对照组更容易出芽,出芽的数量和出芽长度明显增加。16.EPO促进内皮细胞血管新生相关蛋白的表达结果显示,给予EPO刺激后HUVEC或HAEC的MMPs蛋白表达水平和活性明显高于对照组。EPO组细胞的KDR和Tie2表达明显增高。17.pHBSP不能促进HUVEC迁移、体外小管形成和MMPs的表达结果显示,对照组和pHBSP组细胞迁移数量无明显差别,形成小管数量和小管总长度无显着差异。给予pHBSP刺激后HUVEC的MMPs蛋白表达水平和酶活性与对照组无明显差别。18.EPO促进内皮-单核细胞间的粘附作用结果显示,与对照组相比,EPO组粘附的单核细胞数明显增多,由此得出,EPO能够促进内皮-单核细胞间的粘附作用。19.EPO对巨噬细胞炎症因子表达的影响直接给予EPO刺激,巨噬细胞炎症因子的表达无意义;溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果显示,IL-6、IL-1β和TNF-α在6小时明显增高,MCP-1在8小时明显增高,由此得出,内皮细胞参与是EPO诱导巨噬细胞炎症因子上调的关键环节。20.EPO对巨噬细胞MMPs表达的影响溶剂对照或EPO刺激巨噬细胞24小时后,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果发现,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性依然没有明显差别。由此推断,EPO并不能影响巨噬细胞MMPs的表达。21.EPO对平滑肌细胞胶原蛋白、MMPs和凋亡相关蛋白表达的影响给予浓度梯度的EPO刺激HASMC后,其胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2和MMP9表达没有明显变化。EPO组HASMC表达BCL2和BAX与对照组也没有明显差异。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激平滑肌细胞,结果显示,EPO组HASMC表达胶原Ⅰ和胶原Ⅲ明显减少,而MMP2和MMP9蛋白表达和酶活性明显增加。EPO组表达抗凋亡蛋白BCL2明显少于对照组,而表达促凋亡蛋白BAX明显多于对照组。22.EPO对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响结果显示直接给予EPO刺激,诱导的HASMC增殖和凋亡的数量与对照组无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激HASMC,结果显示EPO组TUNEL 阳性细胞比例明显高于对照组,而EDU 阳性细胞比例明显低于对照组。23.EPO在体内水平促进血管新生和炎症浸润14天后从小鼠体内取出基质胶塞显示:混有溶剂对照的基质胶塞呈清晰的黄色,而含有EPO的基质胶塞呈红色,说明基质胶塞内形成了血管。EPO组侵袭的细胞和血管数量明显增多。EPO组CD144和Ki67阳性细胞数量明显高于对照组,说明EPO促进内皮细胞的增殖和迁移。并且EPO组切片CD68阳性细胞浸润程度和炎症因子表达明显高于对照组,这表明EPO促进炎症细胞入侵和炎症因子的表达。24.EPO通过JAK2/STAT5通路诱导血管新生结果显示,EPO明显增强了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,而JAK2抑制剂明显抑制了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,STAT5抑制剂只抑制了 STAT5的磷酸化水平,并没有影响JAK2的磷酸化水平。加入JAK2抑制剂和STAT5抑制剂后明显抑制了内皮细胞闭合管状结构的形成。通过以上结果可知,EPO通过JAK2/STAT5通路促进内皮细胞形成新生血管。25.EPO诱导AAA形成和发展的机制通过以上体内体外实验,我们基本得出EPO诱导AAA形成和发展的机制为:EPO刺激血管内皮细胞,激活JAK2/STAT5通路,促进血管新生、基质金属蛋白分泌、平滑肌细胞凋亡,抑制平滑肌细胞合成胶原蛋白,增强炎性细胞聚集和炎症因子释放,导致AAA的形成和发展。实验结论1.EPO剂量依赖性地促进了 ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的形成,EPO导致ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,EPO导致野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ;2.EPO是通过（EPOR）2同型二聚体发挥作用促进AAA的形成;3.EPO通过引起血管新生、炎症反应和胶原降解而导致AAA的形成;4.EPO通过内皮细胞的介导诱导巨噬细胞表达炎症因子,抑制HASMC胶原分泌,促进HASMC凋亡。研究背景在腹主动脉瘤（AAA）发生发展过程中,由于AAA常与主动脉壁严重动脉粥样硬化损伤相关,因此传统认为AAA是动脉粥样硬化的结果。但这一传统观点近年来受到越来越多的挑战。与不合并动脉粥样硬化性心血管疾病的人群相比,合并冠心病、周围血管疾病、颈动脉疾病、脑血管疾病的患者发生AAA的OR值分别为1.72、1.59、1.51和1.18。在6446例接受颈动脉、股动脉和腹主动脉超声检查的Troms0研究中,斑块负荷与AAA发生率之间无量效关系,提示动脉粥样硬化与AAA可能是伴随关系而非因果关系。糖尿病是动脉粥样硬化的重要危险因素,但却是AAA的保护性因素,在美国310万人AAA流行病学调查中,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者发生AAA的OR值为0.75,提示糖尿病可使AAA风险减少25%。这一反常现象提示,动脉粥样硬化与AAA可能是两个互相独立的疾病。吸烟与AAA的发生有很强的临床联系。吸烟人群中AAA的患病率是终身不吸烟人群的四倍以上。一份比较慢性吸烟者罹患不同疾病的相对风险的报告显示,罹患AAA的风险比罹患冠状动脉疾病的风险高出三倍,比罹患脑血管疾病的风险高出近五倍。2011年在瑞典进行的26256例65岁以上老年男性超声检查结果表明,AAA的发病率已下降至2.2%,其主要原因可能是吸烟人群的减少,提示控制吸烟可能是一个预防AAA的有效策略。基于这些临床观察,慢性吸烟可能是AAA发生发展的最重要的环境危险因素。除了吸烟外,其他危险因素还包括男性、年龄、高血压、慢性阻塞性肺疾病、高脂血症和家族病史。动物模型是一种强有力的工具,可以提供AAA发生和发展机制的理解。目前,AngⅡ注射模型是最常用的AAA动物模型。在高脂喂养的ApoE-/-或LDLR-/-小鼠皮下埋置微量渗透泵,持续注射大剂量Ang Ⅱ,可导致AAA,因此目前有关AAA发生和发展的细胞和分子机制主要来自于这类模型的研究。已提出的AAA发病机制包括:氧化应激机制:AAA患者或小鼠模型中促氧化剂增多,而抗氧化剂减少,从而导致ROS水平的上升,氧化应激增加,刺激血管紧张素转换酶（ACE）表达,内源性Ang Ⅱ增多,炎症反应增强。肾素-血管紧张素激活机制:持续滴注AngⅡ首先导致腹主动脉的炎症反应,继之出现弹性蛋白降解、血管中层断裂和管腔扩张,这些作用通过AT1R所介导,使用ACEI、ARB和ACE2过表达等方法以减少Ang Ⅱ的产生和作用,均可减轻小鼠AAA病变。AMPKa2激活机制:尼古丁和Ang Ⅱ可通过激活细胞膜表面的G蛋白偶联受体增加胞内的活性氧水平,活性氧可激活AMPK,形成AMPKa2/AP-2o/MMP2级联反应,从而活化MMP2的基因转录,最终导致血管壁细胞外基质的降解加速,引发AAA。胶原代谢机制:炎性因子不仅通过刺激MMPs表达而增加细胞外间质的降解,而且使得胶原合成障碍,加速AAA的形成。由于AAA是一个病因不明、病程迁延、病变发展、治疗有限、预后险恶的多因素疾病,且所得出的干预靶点在临床试验中尚无成功的先例,因此,对于AAA发生和发展机制的研究,我们仍处于早期阶段。Ang Ⅱ可以促进特定造血细胞系的増殖,而且Ang Ⅱ也参与了EPO在体内的调控。对健康志愿者的临床研究表明,Ang Ⅱ通过激活AT1R使血清EPO浓度升高约35%或更高。此外,在另一项对健康志愿者的研究中,ACEI类药物卡托普利和依那普利显着降低了血浆EPO水平,降幅高达20-30%。这些发现表明Ang Ⅱ在体内通过受体依赖信号调节EPO的产生,但EPO是否介导了Ang Ⅱ在体内的生物学作用,且引起AAA产生尚无报道。结合本研究论文I和论文Ⅱ的结论,EPO能够导致AAA的产生,因此我们假设在ApoE-/-小鼠中,EPO介导了Ang Ⅱ诱导的AAA的发生和发展,因此我们设计了一系列体内体外实验以验证此假说。研究目的1.探讨EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到的作用;2.探讨Ang Ⅱ诱导野生型小鼠AAA发生率较低的原因;3.探讨Ang Ⅱ作用于EPO的分子机制。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,随机分为4组:其中对照组给予生理盐水持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ组给予Ang Ⅱ持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ+IgG2a组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO尾静脉注射,Ang Ⅱ+EPO中和抗体组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO中和抗体尾静脉注射,4周后小鼠给予安乐死。（2）实验组为EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠,对照组为同窝ApoE-/-小鼠,同时给予Ang Ⅱ持续栗入,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续栗入,实验组给予Ang Ⅱ持续泵入,全程给予普通饲料喂养,4周后小鼠给予安乐死。2.细胞培养和分组（1）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang Ⅱ+替米沙坦（lμM）组,AngII+PD123319（50μM）组,刺激12小时,收集细胞;（2）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang 11+替米沙坦（lμM）组,AngII+U0126（50μM）组,刺激12小时,收集细胞。3.鼠尾血压测量在给予药物干预4周末,应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。4.组织取材步骤小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。5.血常规检测使用兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠全血红细胞计数,血红蛋白含量和红细胞压积。6.免疫组织化学染色腹主动脉组织制备石蜡切片,对IL-6、IL-lβ、MCP-1和TNF-α进行免疫组织化学染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管姐织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测EPO、EPOR、ERK1/2的蛋白含量。8.RNA提取、mRNA逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2-△△CT计算出cDNA的相对表达水平。9.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。10.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;不符合正态分布的数据采用秩和检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;户<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用结果显示,Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组AAA发生率明显增高;Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组之间无显着性差异,而Ang Ⅱ+EP0中和抗体组AAA发生率降为20%。Ang Ⅱ+EP0中和抗体组腹主动脉直径明显降低,死亡率明显下降。2.EPOR在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用由于EPOR-/-纯合小鼠致死,故我们只能获得EPOR+/-杂合小鼠。给予Ang Ⅱ埋泵4周后,结果显示与ApoE+小鼠组相比,EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组AAA发生率明显降低,且腹主动脉直径明显降低,死亡率降低至0。3.EPOR敲除抑制Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠AAA中炎症因子的表达EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组腹主动脉管壁IL-6、IL-lp、MCP-1、TNF-a的表达明显少于ApoE-/-小鼠组。4.各组小鼠血清EPO水平比较ApoE-/-小鼠和野生型小鼠给予Ang Ⅱ千预后,Ang Ⅱ组的血清EPO水平比对照组高出2倍以上。同样给予Ang Ⅱ干预的ApoE-/-小鼠的血清EPO水平显着高于野生型小鼠的血清EPO水平。在野生型小鼠中,EPO注射组导致的血清EPO水平远高于Ang Ⅱ干预组。在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA发病机制中EPO起了至关重要的作用。5.EPO介导了Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠的脾肿大和造血增加解剖小鼠后发现,与对照组相比,Angll组小鼠有明显的脾肿大现象,且脾脏重量明显高于对照组。EPO中和抗体治疗后,脾脏的大小和重量明显减少,且可显着抑制Ang Ⅱ诱导的RBC、HGB和HCT的增加。而EPOR+/-ApoE-/-小鼠与ApoE-/-小鼠相比,经Ang Ⅱ干预后造血表型无明显改变。6.Ang Ⅱ上调EPO表达的机制与对照组相比,Ang Ⅱ组表达EPO水平明显增高,Ang 11+替米沙坦组表达EPO水平显着低于Ang Ⅱ组,Ang Ⅱ+PD123319组表达EPO水平与Ang Ⅱ组无明显差异。Ang Ⅱ+U0126组表达EPO含量明显低于Ang Ⅱ组。Ang Ⅱ对786-0和HASMC有同样的作用。实验结论1.EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到关键性作用;2.血清EPO水平在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-和野生型小鼠AAA发病机制中起到关键作用;3.Ang Ⅱ通过AT1R/ERK1/2通路上调肾脏细胞和平滑肌细胞EPO表达,分别增加循环EPO水平和局部组织EPO水平。
张洋洋[9]（2020）在《慢性肾脏病患者外周血及尿液中促红细胞生成素含量与肾脏纤维化的关系》文中提出目的:通过检测慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）患者外周血及尿液中促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-beta1,TGF-β1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）的含量及变化情况,旨在探讨EPO和TGF-β1、α-SMA的关系及其对肾组织纤维化的影响。方法:选择2019年05月至2019年12月于吉林大学第一医院肾病内科住院行肾穿刺活检的CKD患者78例,参照2009年IgA肾病牛津分型重新病理阅片及分组,将肾小管萎缩和间质纤维化病变程度分为三组,分别为T0组（轻度纤维化组）29例、T1组（中度纤维化组）36例、T2组（重度纤维化组）13例。同时随机选取同期于本院体检中心接受体检的健康人群20例作为健康对照组。分别对患者的年龄、性别、体重、既往病史等一般临床资料及血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血清白蛋白（ALB）、外周血红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HB）等临床指标进行数据收集与整理。通过全自动化学发光免疫分析仪检测各组外周血及尿液中EPO的含量,利用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测外周血及尿液中TGF-β1和α-SMA的含量,通过统计学分析EPO、TGF-β1和α-SMA在不同程度肾组织纤维化患者外周血及尿液中含量及与各相关因素的关系,并探讨EPO对肾组织纤维化的影响。结果:（1）T0组、T1组、T2组外周血中EPO含量分别为12.63±7.98 mIU/mL、15.20±10.34mIU/mL、10.76±5.75 mIU/mL,尿液中EPO含量分别为1.47±1.13 mIU/mL、2.16±1.73mIU/mL、1.37±0.83 mIU/mL;健康对照组外周血中EPO含量为10.30±5.10 mIU/mL,尿液中EPO含量为1.28±0.56 mIU/mL。与健康对照组相比,肾穿刺活检CKD患者外周血及尿液中EPO含量较高,差异具有统计学意义（P<0.001）,其中T1组的EPO含量较T0组和T2组均较高,差异具有统计学意义（P<0.001）。经相关性分析提示外周血中EPO含量与尿液中含量呈正相关,CKD组（r=0.898,P<0.001）,健康对照组（r=0.543,P<0.001）,表明血、尿EPO含量呈平行性变化。（2）T0组、T1组、T2组外周血中α-SMA含量分别为139.49±55.81 ng/L、152.90±186.2 ng/L、165.03±28.46 ng/L,尿液中α-SMA含量分别为62.19±22.91 ng/L、91.50±50.93ng/L、138.28±107.12 ng/L;健康对照组外周血中α-SMA含量为125.30±101.05 ng/L,尿液中为31.06±10.88 ng/L。与健康对照组相比,肾穿刺活检CKD患者外周血及尿液中α-SMA含量均升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,且随着肾组织纤维化程度加重,外周血及尿液中α-SMA逐渐升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）T0组、T1组、T2组外周血中TGF-β1含量分别为10.05±4.87μg/L、12.56±7.85μg/L、22.91±9.32μg/L,尿液中TGF-β1含量分别为4.74±2.24μg/L、7.01±4.27μg/L、9.28±10.21μg/L;健康对照组外周血中TGF-β1含量为6.91±4.45μg/L,尿液中为3.14±1.42μg/L。与健康对照组相比,肾穿刺活检CKD患者外周血及尿液中TGF-β1含量均升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,且随着肾组织纤维化程度加重,外周血及尿液中TGF-β1均逐渐升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）经相关性分析提示肾穿刺活检CKD患者外周血中EPO含量与外周血α-SMA呈弱负相关,且与外周血TGF-β1呈中等负相关,尿液EPO含量与尿液中α-SMA、TGF-β1无相关性。（5）与健康对照组相比,CKD患者BUN、Scr水平明显升高,eGFR水平显着降低,且差异有统计学意义（P<0.05）。三组肾穿刺活检CKD患者之间,Scr、BUN、eGFR有显着差异（P<0.001）,HB、RBC、ALB比较无统计学意义（P>0.05）。（6）Pearson相关性分析提示肾穿刺活检CKD患者外周血及尿液中EPO含量与Scr、BUN、eGFR、HB、RBC、ALB均无相关性。结论:（1）CKD组外周血及尿液中EPO含量均较健康组升高,在轻度及中度纤维化时,EPO水平与肾组织纤维化程度呈正相关,在重度纤维化时,因肾组织损害程度加重EPO水平相对轻度和中度纤维化下降。（2）肾组织纤维化程度同TGF-β1、α-SMA的水平呈正相关。（3）CKD患者体内EPO含量与TGF-β1、α-SMA含量呈负相关,EPO可能通过降低体内TGF-β1、α-SMA的水平,从而具有延缓肾组织纤维化进展的作用。
张园园[10]（2020）在《pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠治疗作用的初步研究》文中研究指明戊二醛聚合猪血红蛋白（Glutaraldehyde-Polymerized Porcine Hemoglobin,pPolyHb）是一种红细胞代用品,具有携氧/释氧功能,前期主要用于治疗急性贫血。本实验以腺嘌呤（Adenine）诱导的慢性肾脏病贫血大鼠为动物模型,通过测定注射pPolyHb后大鼠的贫血相关指标与肾功能参数,探究pPolyHb对慢性肾脏疾病（Chronic kidneydisease,CKD）贫血大鼠的作用。方法:给大鼠灌胃腺嘌呤250mg/kg不同时间,根据大鼠的状态、存活率及贫血判定指标,选出最优CKD贫血动物建模方案。建模后,分别将1、5、7 mg/kg三个剂量pPolyHb和5mg/kg p Hb经大鼠腹腔注射4周,150U/kg ESA皮下注射4周,观察大鼠状态,测定体重、存活率。检测各组大鼠Hb浓度、RBC含量、Ret#等指标,探究pPolyHb对CKD贫血大鼠红细胞系生成的影响。酶联免疫法检测抑制大鼠造血的IL-1β、IL-6及TNF-α水平,同时测定血清中造血促进因子EPO的含量,探究pPolyHb对大鼠造血相关因子的影响。采用生化分析仪测定大鼠血肌酐和尿素氮的水平,并计算肾脏指数。结果:（1）慢性肾脏病贫血大鼠给药pPolyHb（5mg/kg和7mg/kg）后,存活率较NaCl组上升,大鼠体重增加、状态较好。Hb浓度、RBC含量、Ret#恢复至正常水平,纠正了大鼠贫血。（2）5mg/kg和7mg/kg pPolyHb使CKD贫血大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量下降,缓减了炎症因子对造血系统的抑制作用,并且刺激大鼠血清中造血促进因子EPO的含量恢复正常水平,与NaCl组差异极显着（P<0.01）。（3）5mg/kg和7mg/kg pPolyHb可以一定程度降低CKD贫血大鼠体内异常升高的血肌酐和尿素氮浓度,大鼠体内积累的毒性物质有所减少。（4）注射阳性药物ESA后,大鼠RBC含量、Ret#均显着高于其他各组,P<0.01;存活率较注射5mg/kg和7mg/kg pPolyHb低。结论:本实验表明5mg/kg和7mg/kg pPolyHb对腺嘌呤所致的慢性肾脏病贫血大鼠具有一定的造血刺激作用,通过增加体内EPO水平提高大鼠的Hb浓度、RBC含量,从而纠正贫血;可以在一定程度上降低造血抑制相关的炎症因子,降低大鼠血清中肌酐和尿素氮的水平,缓减肾脏损伤。并且,pPolyHb提高贫血大鼠RBC含量的水平较阳性药物ESA更平缓稳定,大鼠存活率更高,安全性相对较好。
二、肿瘤患者体内促红细胞生成素浓度测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤患者体内促红细胞生成素浓度测定（论文提纲范文）
（1）肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 肾藏精理论研究 |
| 1.1 肾精的生成来源 |
| 1.2 肾精的功能 |
| 1.3 肾精的现代医学研究 |
| 2 “髓”的理论研究 |
| 2.1 “髓”的含义及生理功能 |
| 2.2 “髓”的生成与肾精 |
| 2.3 “骨髓”的现代医学研究 |
| 3 “血”的研究理论 |
| 3.1 血的涵义及生理功能 |
| 3.2 血的生成与肾精 |
| 3.3 贫血的现代医学研究 |
| 4 补肾方龟鹿二仙胶 |
| 5 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验1 肾精亏虚对SD雄性大鼠造血功能影响的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 造模方法及分组、给药 |
| 1.6 检测指标及方法 |
| 1.7 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 红细胞数量(RBC)、血红蛋白(HGB)含量比较 |
| 2.3 血清促红细胞生成素(EPO)、睾酮(T)含量比较 |
| 2.4 附睾精子质量比较 |
| 2.5 睾丸组织病理学比较 |
| 2.6 骨髓象比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肾精亏虚大鼠模型的建立 |
| 3.2 肾精亏虚大鼠造血组织形态学的改变 |
| 3.3 肾精亏虚对血清EPO含量的影响 |
| 实验2 肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血细胞及CD34+细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器设备及试剂 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠骨髓造血干细胞的超微病理形态学观察 |
| 2.2 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的结果 |
| 2.3 骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测CD34+细胞凋亡结果 |
| 3 讨论 |
| 实验3 肾精亏虚对SD雄性大鼠导致骨髓造血细胞凋亡的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器、试剂及耗材 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和 Fasl蛋白表达结果 |
| 2.2 骨髓 Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas 和 FaslmRNA RT-PCR 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肾精亏虚对大鼠骨髓Fas/Fasl蛋白表达的影响 |
| 3.2 肾精亏虚对大鼠骨髓Bcl-2、Bax蛋白及Bcl-2m RNA、Baxm RNA表达的影响 |
| 3.3 肾精亏虚对大鼠骨髓Caspase-3 表达的影响 |
| 讨论 |
| 1.肾精亏虚与贫血的关系 |
| 2.肾精亏虚大鼠模型建立评估 |
| 3.肾精亏虚对骨髓造血功能影响的可能机制 |
| 4.龟鹿二仙胶改善骨髓造血功能的作用机制 |
| 结论 |
| 展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 综述 肾虚与贫血关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 2 发表论文 |
| 致谢 |
（2）终末期肾脏病患者促红素低反应性相关因素研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 综述 终末期肾脏病患者促红素低反应性相关因素研究 |
| 1.2.1 促红细胞生成素的结构与功能 |
| 1.2.2 炎症及氧化应激状态 |
| 1.2.3 循环中存在的促红细胞生成素抑制物 |
| 第2章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 入选标准 |
| 2.1.2 排除标准 |
| 2.2 标本处理 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 主要实验仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 实验原理 |
| 2.5.2 实验步骤 |
| 2.6 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 终末期肾病实验组与对照组临床资料比较结果 |
| 3.2 终末期肾病患者不同分组方式组间比较结果 |
| 3.2.1 透析方式不同组间实验室参数比较 |
| 3.2.2 原发病因不同组间参数比较 |
| 3.3 终末期肾病患者炎症及氧化应激相关因素 |
| 3.3.1 不同亚组血清AGES水平的组间比较 |
| 3.3.2 不同亚组血清RAGE水平的组间比较 |
| 3.3.3 终末期肾病患者血清AGEs与RAGE水平相关关系 |
| 3.3.4 AGEs及RAGE与肾小球滤过率相关关系 |
| 3.3.5 AGEs及RAGE与血清肌酐相关关系 |
| 3.3.6 AGEs及RAGE与超敏C-反应蛋白相关关系 |
| 3.4 终末期肾病患者循环中促红素抑制物因素分析 |
| 3.4.1 促红素抗体在ESRD患者中的阳性率 |
| 3.4.2 ESRD患者血清EPOR水平与实验室参数相关关系 |
| 3.4.3 EPOR水平与超敏C-反应蛋白相关关系 |
| 3.4.4 ESRD患者EPOR水平与血红蛋白相关关系 |
| 3.5 不同血红蛋白分组中各因素水平比较 |
| 3.6 AGEs和RAGE促红素低反应性的中的诊断价值 |
| 3.7 EPOR在ESRD患者促红素低反应性中的诊断价值 |
| 3.8 发生促红素低反应性的危险因素分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 终末期肾病患者一般资料分析 |
| 4.2 炎症及氧化应激因素与促红素反应性分析 |
| 4.3 循环中抑制物与促红素反应性分析 |
| 本研究创新点 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及学期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）EPO在炎症状态下对血管钙化的影响及机制的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 EPO对血管平滑肌细胞钙化的影响及其分子机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 炎症状态下EPO对血管平滑肌细胞钙化的影响及相关机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 炎症状态下EPO对SD大鼠血管钙化的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:促红细胞生成素的生理功能及其在临床治疗中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（4）右归饮益精生血的作用机制及其与EPO的相关性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 肾精亏虚贫血大鼠模型评价及其与EPO的相关性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 腺嘌呤致大鼠肾精亏虚评价 |
| 3.2 腺嘌呤致大鼠贫血评价 |
| 3.3 腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠模型成功的判定依据 |
| 3.4 腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠EPO减少 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠的的改善作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠体质的改善 |
| 3.2 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠血常规指标的改善 |
| 3.3 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠炎症指标的改善 |
| 3.4 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠肾脏纤维化的改善 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 右归饮改善肾精亏虚贫血大鼠的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 右归饮显着升高肾精亏虚贫血大鼠血清和肾脏中EPO的水平 |
| 3.2 右归饮能调控肾精亏虚贫血大鼠肾脏中EPO上游PHD2/HIF2α通路中相关蛋白的表达 |
| 3.3 右归饮能显着上调肾精亏虚贫血大鼠肾脏中EPO上游PI3K/AKT/m TOR/HIF1α通路中相关蛋白的表达 |
| 3.4 右归饮能显着上调肾精亏虚贫血大鼠肾脏中EPO下游JAK2/STAT5 通路中相关蛋白的表达 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 右归饮益精生血作用机制与EPO相关的逻辑探讨(理论分析) |
| 1.肾精与EPO的主要生成来源相似 |
| 2.肾精与EPO对于机体生理功能均具有非同一般的重要作用 |
| 3.肾精亏虚与EPO降低对机体疾病的发生发展均具有重要影响 |
| 4.补充外源性EPO能够改善肾精亏虚证贫血大鼠的体质 |
| 5.补肾益精名方右归饮改善肾精亏虚贫血大鼠体质的同时伴随着EPO升高 |
| 全文总结 |
| 创新点及意义 |
| 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 促红细胞生成素与中医肾精的相似性探讨 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间科研工作汇报 |
| 附录:中英文缩略词对照表 |
| 动物外观图片 |
（5）血清铁蛋白和促红细胞生成素在骨髓增生异常综合征的表达和临床意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 临床资料收集 |
| 2.2 检测项目及方法 |
| 2.3 随访及终点 |
| 3 统计学方法 |
| 4 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 促红细胞生成素在骨髓增生异常综合征的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 新疆医科大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（6）肾性贫血治疗药物-口服低氧诱导因子-脯氨酰羟化酶（HIF-PHD）抑制剂的筛选及候选化合物DS015的药效验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 慢性肾脏病研究进展 |
| 1.1.1 慢性肾脏病 |
| 1.1.2 慢性肾脏病流行病学概述 |
| 1.1.3 致病因素分析 |
| 1.2 肾性贫血研究进展 |
| 1.2.1 肾性贫血 |
| 1.2.2 贫血在CKD中的流行病学概述 |
| 1.2.3 贫血临床表现及预后 |
| 1.2.4 肾性贫血发病机理 |
| 1.3 选题依据及研究目的 |
| 1.3.1 肾性贫血药物治疗现状及常用药物 |
| 1.3.2 肾性贫血未满足的临床需求 |
| 1.3.3 国内外药物研发进展 |
| 1.4 HIF-PHD在造血生理过程中的作用及机制 |
| 1.4.1 药理作用及作用机制 |
| 1.4.2 HIF和 PHD的亚型、分布及功能 |
| 1.5 研究意义 |
| 1.6 研究目标 |
| 1.7 研究内容 |
| 1.7.1 参比化合物的选择 |
| 1.7.2 实验内容 |
| 1.8 本课题的研究方法与技术路线图 |
| 1.9 研究创新点 |
| 第二章 HIP-PHD抑制剂的体内外筛选评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 试剂及耗材 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 受试化合物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 化合物对Hep3B细胞EPO分泌影响的体外活性测试 |
| 2.3.2 化合物的药代动力学参数测定 |
| 2.3.3 化合物体内单次给药对小鼠血浆EPO的影响 |
| 2.3.4 化合物体内安全性的初步评价 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 化合物对Hep3B细胞EPO分泌影响的体外活性测试 |
| 2.4.2 化合物的药代动力学参数测定 |
| 2.4.3 化合物体内单次给药对小鼠血浆EPO的影响 |
| 2.4.4 化合物体内安全性初步评价 |
| 2.5 讨论和小结 |
| 第三章 候选化合物DS015体内外药效学验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 试剂及耗材 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 DS015对HIF-PHD1/2/3 的酶活性测试 |
| 3.3.2 DS015对重组细胞系EPO转录及表达的影响 |
| 3.3.3 DS015 对炎症因子抑制Hep3B细胞分泌EPO的影响 |
| 3.3.4 DS015在健康食蟹猴中的药理活性评价 |
| 3.3.5 DS015在大鼠5/6肾切除贫血模型中的药效研究 |
| 3.3.6 DS015在庆大霉素诱导肾性贫血模型中的药效研究 |
| 3.3.7 DS015在顺铂诱导肾性贫血模型中的药效研究 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 DS015对HIF-PHD1 /2/3的酶活性测试 |
| 3.4.2 DS015体外细胞活性测试 |
| 3.4.3 DS015在健康食蟹猴中的药理活性评价 |
| 3.4.4 DS015在大鼠肾性贫血模型中的药效研究 |
| 3.5 讨论和小结 |
| 主要研究结论与展望 |
| 主要研究结论 |
| 后期研究展望 |
| 后续工作 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）补肾生髓方治疗CKD3-4期rHuEPO抵抗肾性贫血的临床观察（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.现代医学对促红细胞生成素抵抗的认识 |
| 1.1 .促红细胞生成素抵抗的流行病学研究进展 |
| 1.2 .促红细胞生成素抵抗发病机制的研究 |
| 1.3 肾性贫血促红细胞生成素抵抗的临床表现 |
| 1.4 现代医学的主要治疗方式 |
| 2.中医对促红素抵抗肾性贫血的认识 |
| 2.1 理论渊源 |
| 2.2 中医病因病机 |
| 2.3 中医对本病的治疗进展 |
| 临床研究 |
| 资料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 诊断标准 |
| 2.1 西医诊断标准 |
| 2.2 中医证候诊断标准: |
| 2.3 病例纳入标准 |
| 2.4 病例排除标准 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 治疗方法 |
| 3.3 观察指标 |
| 3.4 疗效判定标准 |
| 3.5 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 一般资料分析 |
| 2 疗效情况 |
| 2.1 贫血类指标疗效情况 |
| 2.2 .肾功能指标疗效情况 |
| 2.3 .促红素抵抗类指标疗效分析 |
| 2.4 .中医证候评分分析 |
| 2.5 .总疗效分析 |
| 2.6 .安全性结果检测 |
| 讨论 |
| 1 补肾生髓方治疗促红素抵抗的肾性贫血临床意义探讨 |
| 2.补肾生髓方汤药分析 |
| 2.1 主要配伍分析 |
| 2.2 主要药物的现代药理研究 |
| 3.促红细胞生成素的临床研究 |
| 4 补肾生髓方的临床疗效分析 |
| 4.1 补肾生髓方对促贫血类指标疗效分析 |
| 4.2 补肾生髓方对肾功能指标疗效分析 |
| 4.3 补肾生髓方对促红素抵抗类指标疗效分析 |
| 4.4 补肾生髓方对中医证候疗效分析 |
| 5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表1 |
| 附表2 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（8）促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 促红细胞生成素诱导小鼠发生腹主动脉瘤的作用及分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 促红细胞生成素在血管紧张素II诱导腹主动脉瘤小鼠模型中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 外文论文3 |
（9）慢性肾脏病患者外周血及尿液中促红细胞生成素含量与肾脏纤维化的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 慢性肾脏病的概述 |
| 2.1.1 慢性肾脏病的诊断及病因 |
| 2.1.2 慢性肾脏病的流行病学 |
| 2.2 肾脏纤维化的发病机制 |
| 2.3 促红细胞生成素的概述 |
| 2.3.1 促红细胞生成素的来源及结构 |
| 2.3.2 促红细胞生成素的生物学效应 |
| 2.4 促红细胞生成素对肾脏纤维化的影响机制 |
| 2.4.1 促红细胞生成素和肌成纤维细胞 |
| 2.4.2 促红细胞生成素和上皮-间充质转化 |
| 2.4.3 促红细胞生成素与细胞凋亡 |
| 2.4.4 促红细胞生成素的抗炎作用 |
| 2.4.5 促红细胞生成素和自噬作用 |
| 2.5 总结与展望 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 研究对象及分组 |
| 3.1.1 实验组入选标准及排除标准 |
| 3.1.2 肾组织纤维化严重程度分级 |
| 3.2 标本收集、保存、处理及试剂准备 |
| 3.3 外周血及尿液中EPO含量测定 |
| 3.3.1 主要仪器及试剂 |
| 3.3.2 实验原理及操作步骤 |
| 3.4 外周血及尿液中TGF-β1、α-SMA含量测定 |
| 3.4.1 主要仪器与试剂 |
| 3.4.2 实验原理及操作步骤 |
| 3.5 统计学方法 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 一般资料分析 |
| 4.1.1 CKD患者和健康对照组年龄、性别比较 |
| 4.1.2 CKD患者一般临床特点比较 |
| 4.2 外周血及尿液中EPO含量 |
| 4.3 外周血及尿液中EPO含量相关性 |
| 4.4 外周血及尿液中α-SMA与 TGF-β1 含量 |
| 4.4.1 外周血及尿液中α-SMA含量 |
| 4.4.2 外周血及尿液中TGF-β1 含量 |
| 4.5 EPO含量与TGF-β1、α-SMA含量相关性 |
| 4.5.1 外周血EPO含量与外周血TGF-β1 含量相关性 |
| 4.5.2 外周血EPO含量与外周血α-SMA含量相关性 |
| 4.5.3 尿液EPO含量与尿液TGF-β1、α-SMA含量相关性 |
| 4.6 相关实验室指标比较 |
| 4.7 EPO含量与临床指标相关性分析 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠治疗作用的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 慢性肾脏疾病与贫血 |
| 1.1.1 慢性肾脏疾病特点 |
| 1.1.2 慢性肾脏疾病贫血症状与危害 |
| 1.1.3 慢性肾脏疾病贫血成因 |
| 1.2 慢性肾脏病贫血的治疗 |
| 1.2.1 贫血的治疗药物与研究进展 |
| 1.2.2 红细胞生成刺激剂(ESA) |
| 1.2.3 低氧诱导因子稳定剂(HIF稳定剂) |
| 1.3 戊二醛聚合猪血红蛋白(pPolyHb)的研究进展 |
| 1.3.1 pPolyHb在治疗急性贫血动物的研究 |
| 1.3.2 pPolyHb在治疗化疗性贫血动物实验的发现 |
| 1.4 本文研究意义与思路 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 本文研究思路 |
| 第二章 慢性肾脏病贫血大鼠模型的建立及测定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物分组及模型建立 |
| 2.3.2 大鼠血样采集与留存 |
| 2.3.3 大鼠称重与状态记录 |
| 2.3.4 大鼠血红蛋白浓度及外周血红细胞数的测定 |
| 2.3.5 大鼠血清中肌酐和尿素氮含量测定 |
| 2.4 统计学分析方法 |
| 2.5 结果分析 |
| 2.5.1 腺嘌呤不同建模时间大鼠的状态、体重变化和存活率 |
| 2.5.2 腺嘌呤不同建模时间大鼠血红蛋白浓度及红细胞数的测定 |
| 2.5.3 腺嘌呤不同建模时间大鼠肾功能参数的变化 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠红细胞系的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物分组及处理 |
| 3.3.2 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠一般状态的影响 |
| 3.3.3 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠体重和存活率的影响 |
| 3.3.4 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血红蛋白和红细胞含量的影响 |
| 3.3.5 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠网织红细胞参数的影响 |
| 3.4 统计学分析方法 |
| 3.5 结果分析 |
| 3.5.1 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠一般状态的影响结果 |
| 3.5.2 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠体重和存活率的影响结果 |
| 3.5.3 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血红蛋白浓度的影响结果 |
| 3.5.4 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠红细胞的影响结果 |
| 3.5.5 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠网织红细胞参数的影响结果 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠造血促进因子的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 实验仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠血清造血促进因子EPO水平的检测 |
| 4.4 统计学分析方法 |
| 4.5 结果分析 |
| 4.5.1 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠造血促进因子EPO水平的影响结果 |
| 4.6 讨论 |
| 第五章 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠造血抑制相关炎症因子的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 动物分组及处理 |
| 5.3.2 大鼠血样的采集与处理 |
| 5.3.3 大鼠血清中IL-1β水平的测定 |
| 5.3.4 大鼠血清中TNF-α水平的测定 |
| 5.3.5 大鼠血清中IL-6水平的测定 |
| 5.4 统计学分析方法 |
| 5.5 结果分析 |
| 5.5.1 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血清IL-1β的影响结果 |
| 5.5.2 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血清TNF-α的影响结果 |
| 5.5.3 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血清IL-6 的影响结果 |
| 第六章 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠肾脏功能的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 动物分组及处理 |
| 6.3.2 大鼠血样的采集与处理 |
| 6.3.3 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血清中肌酐和尿素氮的影响 |
| 6.3.4 大鼠肾脏指数的测定 |
| 6.4 结果分析 |
| 6.4.1 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血清中尿素氮的影响结果 |
| 6.4.2 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠血清中肌酐的影响结果 |
| 6.4.3 pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠肾脏指数的影响结果 |
| 6.5 讨论 |
| 总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、肿瘤患者体内促红细胞生成素浓度测定（论文参考文献）
- [1]肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究[D]. 吕建芳. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]终末期肾脏病患者促红素低反应性相关因素研究[D]. 李海男. 吉林大学, 2021(01)
- [3]EPO在炎症状态下对血管钙化的影响及机制的研究[D]. 李逊佳. 重庆医科大学, 2021(01)
- [4]右归饮益精生血的作用机制及其与EPO的相关性[D]. 杨欢. 西南大学, 2021(01)
- [5]血清铁蛋白和促红细胞生成素在骨髓增生异常综合征的表达和临床意义[D]. 买丽克·吾麦尔. 新疆医科大学, 2021(09)
- [6]肾性贫血治疗药物-口服低氧诱导因子-脯氨酰羟化酶（HIF-PHD）抑制剂的筛选及候选化合物DS015的药效验证[D]. 郑晓敏. 华南理工大学, 2020(02)
- [7]补肾生髓方治疗CKD3-4期rHuEPO抵抗肾性贫血的临床观察[D]. 王华宇. 黑龙江中医药大学, 2020(01)
- [8]促红细胞生成素导致腹主动脉瘤形成的作用及分子机制研究[D]. 章萌. 山东大学, 2020(12)
- [9]慢性肾脏病患者外周血及尿液中促红细胞生成素含量与肾脏纤维化的关系[D]. 张洋洋. 吉林大学, 2020(08)
- [10]pPolyHb对慢性肾脏病贫血大鼠治疗作用的初步研究[D]. 张园园. 西北大学, 2020(02)