一、利用NCBI相关资源电子定位基因的方法和实践（论文文献综述）
谢海婷[1]（2021）在《基于NCBI数据库的高中生物学课程资源开发与利用》文中研究表明《普通高中生物学课程标准（2017年版2020年修订）》指出要积极开发与利用生物学课程资源,注重生命观念中信息观的构建,新增了“生物信息学与人类基因组”模块。生物信息数据库收录了大量的生物和生物信息方面的数据,几乎涵盖了生命科学的各个领域,其中蕴含着大量可供生物学教学的生物信息资源未被开发。因此,本研究选取一个综合型的数据库——NCBI数据库（美国生物技术信息中心）作为研究对象,开发适用于高中生物学课程的NCBI数据库课程资源,在日常教学中渗透生物信息数据库的相关知识,构建学生的信息观,为后续的学习奠定基础。本研究以认知学习理论、多元化智能学习理论、建构主义学习理论为基础,选用文献研究法、问卷调查法、案例分析法等研究方法。首先归纳国内外关于课程资源与NCBI的研究现状,确定研究主题,明确研究意义;问卷调查当地生物教师对课程资源的开发与利用现状及NCBI数据库的了解程度;研习高中生物新教材,以《分子与细胞》、《遗传与进化》两本教材为依据,从NCBI数据库中筛选出与高中生物学知识紧密联系的数据库,获取并处理成图像资源,依据NCBI数据库的资源具有的形式多样性、内容科学性、价值潜在性等优势,总结归纳开发NCBI数据库资源需要遵循有效性原则、实用性原则、匹配性原则以及开放性原则,制作并发放成果评价问卷;利用基于NCBI数据库所开发的成果,制作三个详细的教学案例,并对“遗传与进化”模块的内容,选择广西某中学的两个实验班进行一个学期的课堂实践,以检验开发成果的可行性与教学效果,最后整理归纳形成论文。通过上述研究,得到以下结论:（1）这两个班的学生在运用基于NCBI数据库开发的课程资源进行课堂教学前后,其学习兴趣、生命观念、科学思维与科学探究及社会责任四个维度的均值方程t检验显着（双尾）值皆为0.00<0.05,存在显着性差异,说明本研究所开发的课程资源应用于辅助高中生物学教学是可行的。（2）教师可以根据教学需要,开发出紧密结合生物知识点的课程资源,创设不同的教学情境,有利于学生直观理解生物学知识,培养学生的核心素养,尤其是生命观念和科学探究能力。（3）通过现状调查分析,当地生物教师对生物信息数据库的认知与运用能力比较缺乏,但对于该数据库作为课程资源开发的工具给予期望。在对开发成果进行评价时,本研究所开发的课程资源得到广大教师的认可。大部分教师认为该课程资源在高中生物学课堂教学中的应用较优秀,并指出开发的数据图像效果直观。这说明了虽然当前大部分生物教师对于生物信息数据库的认识不足,导致开发意识薄弱,但只要给予足够的指导与培训,越来越多的生物教师也会加入到生物信息数据库的开发与应用的队伍中。因此,笔者认为NCBI数据库课程资源在高中生物学课堂教学中具有独特的优势与重要性,应鼓励生物教师以及生物教学研究者积极对其开发利用。本研究中的开发成果以及教学设计可为生物教师今后对生物信息数据库进行开发利用作为参考,希望能够集中各方力量建立属于国人自己的高中生物信息数据库课程资源平台,以便适应新课标要求,提升教师的专业化素养,形成学生的生物学核心素养。
郑宇涵[2]（2021）在《水稻抗白叶枯病基因x349的精细定位和两个类病斑早衰突变体基因的图位克隆》文中研究表明由黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xoo）引起的水稻白叶枯病一直是制约我国水稻高产的细菌性病害。种植抗病品种是一种经济有效且对环境友好的防治手段,因此不断鉴定和挖掘抗白叶枯病基因新资源并解析其抗病机理成为重中之重。本研究通过化学诱变剂EMS处理水稻籼稻感白叶枯病品种JG30,筛选到一个遗传稳定的抗白叶枯病新材料x349和两个类病斑突变体。主要研究成果如下:首先,利用国内外31个白叶枯病菌代表菌系对抗白叶枯病材料x349在分蘖盛期进行抗性鉴定,发现均表现出高抗,表明突变体x349是一个广谱抗白叶枯病材料。本研究以一个感白叶枯病粳稻品种JG88与x349杂交F2代的2290个单株为作图群体,采用Indel分子标记对抗白叶枯病基因x349进行精细定位。初步将目的基因定位在水稻第2号染色体长臂分子标记ID28和ID37之间。进一步开发新的Indel分子标记,又筛选到9个位于2号染色体末端的分子标记与x349紧密连锁。根据交换单株的情况,标记ID45,ID80,ID84和ID90位于基因的同侧,标记ID48,ID51,ID62和ID74位于基因的另一侧。同时开发出一个位于ID90和ID74之间的共分离标记ID69。根据各标记在2号染色体上的位置,将抗白叶枯病基因x349定位在2号染色体末端分子标记ID90和ID74之间,物理距离大约90.6kb。并对该区间的基因进行了预测,其中有2个候选基因与抗病相关。植物类病斑突变体是研究细胞程序性死亡和防御反应的理想模型。本研究通过甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate,EMS）诱变籼稻品种JG30获得两份水稻类病斑突变体msl-1和msl-2。主要结果如下:两份突变体在苗期表现出相似的类病斑,但随着植株的发育表现出不同的表型。在分蘖期,msl-2叶片出现大面积橘黄色类病斑,数目较多,而msl-1出现小面积棕褐色斑点,数目较少。至抽穗期,msl-2植株叶片全部枯黄,而msl-1植株即使表现出明显的早衰,但仍有绿色叶片。两份msl突变体的类病斑发生都受光诱导,DAB和台盼蓝染色显示类病斑部位存在活性氧（ROS）富集,清除酶系统中的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性较野生型降低。突变体中检测到光合色素含量下降、叶绿体解体、衰老相关基因上调、叶绿体合成基因和光合相关基因表达下降,总体上msl-2比msl-1更严重。本研究以02428和突变体msl-1和msl-2分别杂交构建F2定位群体,目的基因定位在12号染色体分子标记S1和L4之间,物理距离大约为58kb。图位克隆表明突变体的类病斑和早衰性状均由SL（Sekiguchi lesion）基因的隐性突变等位基因控制,该基因编码属于细胞色素P450单加氧酶家族的CYP71P1蛋白。突变位点和突变类型（SNP引起的单个氨基酸变化和SNP引起的翻译提前终止）的差异导致msl-1和msl-2之间在严重程度的不同表型差异。综上所述,本研究揭示了CYP71P1参与水稻早衰和细胞死亡的调控,其不同的突变位点和突变类型可导致不同的严重程度的表型。
范睿深[3]（2021）在《山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析》文中研究指明山桐子是十分重要的木本油料植物,其果实含油率高,亚油酸含量在60%以上具有“树上油库”的美称,在食品、保健品、医药、化工等方面拥有多种用途,具有很高的开发利用价值。选育优良品种,是开发利用山桐子的前提,然而由于缺乏山桐子果实油脂合成相关基因的理论研究及完善的遗传转化体系,严重制约了山桐子这一优良油料树种的良种选育。深入了解山桐子油脂合成相关基因的分子调控机理和功能,对山桐子果实资源的开发具有重要的意义,建立山桐子遗传转化体系有利于利用分子育种技术对山桐子进行遗传改良,还能为其他油料植物基因功能的研究提供借鉴。本研究以山桐子果实为试验材料,分析了不同发育时期山桐子果实的油脂含量及脂肪酸组分的动态变化,对山桐子油脂合成相关基因进行挖掘。在此基础上对油脂合成有关基因成功进行了克隆,从中选出与亚油酸合成有关的基因,通过表达分析验证其基因功能。为了进一步对山桐子进行遗传改良,以叶片为外植体,建立了山桐子遗传转化受体系统,取得以下结果:（1）揭示了山桐子果实不同发育时期油脂含量及脂肪酸组分的动态变化规律。在山桐子果实发育过程中,含油率逐渐增加呈“S”型增长模式,在80～90 DAP（days after pollination）有一个间歇期,在此时期果实颜色发生变化;亚油酸含量在脂肪酸组分中的比例逐渐减小,但其最终值仍在64%以上,在70 DAP和130 DAP时期,果实中的油脂含量,主要脂肪酸组分均差异显着。（2）通过转录组测序发掘油脂合成相关基因。从转录组中发掘出了33个与山桐子油脂合成有关的基因,其中有18个基因在70 DAP和130 DAP的表达量差异显着。其中,Ip ACCase、Ip KAS I、Ip KAS II、Ip SAD、Ip FAD2和Ip FAD3等6个基因是山桐子脂肪酸合成的关键基因;Ip GPAT和Ip DGAT2等2个基因是山桐子TAG合成的关键基因。（3）克隆获得了Ip SAD、Ip FAD2、Ip FAD3、Ip GPAT和Ip DGAT2等5个山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的全长序列。系统进化树结果显示,它们与毛果杨和胡杨的亲缘关系较近。预测蛋白的生物信息学分析推测,这5个功能基因在山桐子油酸、亚油酸及油脂合成过程中发挥着关键作用。（4）对亚油酸合成关键基因Ip FAD2和Ip DGAT2的功能进行了验证。原核表达载体的重组质粒在IPTG的诱导下可以正常表达出与预测蛋白大小基本一致且具有生物活性的蛋白;转化拟南芥表明,转Ip FAD2和转Ip DGAT2分别可以使拟南芥种子的亚油酸和油脂含量增加13.50～29.86%和27.70～39.09%;Ip FAD2和Ip DGAT2的表达量决定了山桐子果实中亚油酸含量及油脂含量。（5）建立了山桐子叶片愈伤组织遗传转化受体系统。愈伤组织诱导最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,诱导率为36.67%;愈伤组织继代最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,愈伤组织增值系数为4.46;不定芽诱导最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,不定芽诱导率为22.22%;不定芽复壮最适培养基:MS+蔗糖30 g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+TDZ 0.08 mg/L+琼脂6 g/L（p H=5.8）,增值系数为4.45。抗生素敏感性试验表明,Cef对愈伤组织致死的最大浓度为200 mg/L,Kan对愈伤组织致死的最小浓度为50 mg/L。
谭亚红[4]（2021）在《哈氏噬纤维菌LPS合成相关基因chu2177、chu2178、chu1927、chu2532和chu3392的功能研究》文中研究说明哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）是一种在土壤中广泛存在的好氧的革兰氏阴性菌,属于拟杆菌门（Bacteroidetes）,它没有游离纤维素酶系和纤维小体结构,采用一种全新且未知的方式高效降解纤维素。此外,C.hutchinsonii不依赖于鞭毛或纤毛却能在固体介质表面滑动,其运动机制尚不清楚。Ⅸ型分泌系统（T9SS）在拟杆菌门细菌中广泛存在且仅存在于拟杆菌门中。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）T9SS对底物蛋白的分泌机制研究得最为清楚。具有C端保守结构域（C-terminalconserved domain,CTD）的蛋白质（包括其主要毒力因子半胱氨酸蛋白酶）在P.gingivials细胞质中合成并通过T9SS分泌到细胞表面,然后通过与阴离子脂多糖（anioniclipopolysaccharide,A-LPS）相连而锚定于细胞表面。T9SS和A-LPS对P.gingivalis的致病性至关重要。C.hutchinsonii有T9SS的全部同源蛋白,前期研究发现T9SS核心组分在纤维素降解和滑动中发挥着重要的作用,并且T9SS分泌的许多CTD蛋白在菌体的纤维素降解中起关键作用,但C.hutchinsonii是否存在A-LPS以及T9SS分泌的CTD蛋白的锚定机制仍不清楚。本文通过转座子插入突变的方法得到一万多个转化子,通过在铺有滤纸的平板上筛选到滤纸降解缺陷株54个,利用反向PCR技术鉴定插入位点,随后进行生物信息学分析并选择32个基因进行单敲除,发现其中5个基因与LPS的合成相关,进一步研究了这5个基因的具体功能,并探讨了 LPS合成影响纤维素降解的机制。具体研究内容如下:C.hutchinsonii的chu2177、chu2178的功能研究:根据NCBI功能注释,预测chu2177编码O-抗原连接酶,其下游基因chu2176编码O-抗原或壁磷酸的转运蛋白,上游基因chu2178编码一个未知功能蛋白。C.hutchinsonii还存在一个预测编码O-抗原连接酶的chu 0602。通过生物信息学分析及各个菌株的LPS银染图,证实chu2176编码O-抗原翻转酶,chu2177编码O-抗原聚合酶,chu2178编码O抗原链长决定蛋白,chu 0602编码O-抗原连接酶,这些基因都参与LPS的合成,并且C.hutchinsonii只产生一种LPS。此外,Δ2177、Δ2178均不能降解滤纸和结晶纤维素且菌体滑动缺陷,缺陷菌株对纤维素吸附能力显着降低、胞外多糖减少、生物膜形成出现障碍以及抗逆性下降。C.hutchinsonii的纤维素酶主要位于细胞外膜,而Δ2177和Δ2178的外膜中纤维素酶活显着降低,胞外纤维素酶活则增加,推测纤维素酶在突变株的外膜锚定失败而游离到了胞外。提取WT、Δ2177和Δ2178的外膜和胞外蛋白并进行质谱鉴定,发现Δ2177和Δ2178外膜CTD蛋白减少约60%,胞外CTD蛋白则显着增加。外膜减少的CTD蛋白为A型CTD蛋白,包括影响纤维素降解的外膜蛋白CHU0922,3个内切纤维素酶和7个糖苷水解酶家族蛋白。这表明C.hutchinsonii的A型CTD蛋白可能是通过LPS锚定于外膜的。于是我们利用A型CTD蛋白内切纤维素酶CHU1336的抗体对CHU1336定位,发现在野生型中定位于外膜的CHU1336在Δ2177和Δ2178的外膜并未检测到,反而出现在胞外基质中,证明LPS的缺陷会影响包括纤维素酶在内的一些A型CTD蛋白在外膜的锚定。研究还发现突变株外膜中一些不含CTD的蛋白的表观分子量比野生型的小,推测这些外膜蛋白可能存在LPS修饰。提取WT的LPS并测定其单糖成分,发现可能存在甘露糖、核糖、半乳糖醛酸和岩藻糖成分。我们用能识别岩藻糖基化蛋白的凝集素AAL对WT、Δ2177和Δ2178的外膜蛋白进行检测,发现WT有大量岩藻糖基化蛋白,而Δ2177和Δ2178的外膜中未检测到糖蛋白,进一步表明这些蛋白可能存在LPS修饰。C.hutchinsonii中非CTD蛋白的LPS糖基化修饰机制还有待进一步研究。我们推测LPS的O-抗原寡糖链合成并翻转到周质空间后,除了参与LPS的合成,还可能通过寡糖基转移酶将其转移到蛋白上形成糖基化蛋白。综上,我们发现C.hutchinsonii仅存在一种LPS,LPS缺陷通过影响外膜非CTD蛋白的LPS糖基化修饰和CTD蛋白在细胞表面的锚定使菌体的纤维素酶活和纤维素吸附能力下降,从而影响纤维素降解。C.hutchinsonii的chu 1927、chu2532、chu 3392的功能研究:通过生物信息学分析,预测chu1927编码合成O-抗原的起始酶,chu2532编码合成O-抗原的糖基转移酶,chu3392编码合成O-抗原糖前体的脱氢酶。chu1927、chu2532和chu3392的单独敲除使菌体的LPS的O抗原缺失,说明chu1927、chu2532和chu3392参与O-抗原的合成,并进一步证实C.hutchinsonii只产生一种LPS。Δ1927、Δ2532、Δ3392不能降解滤纸和结晶纤维素且菌体滑动缺陷。此外,还发现缺陷菌株的纤维素酶活降低、外膜蛋白的表观分子量比野生型的小、对纤维素吸附能力显着降低、胞外多糖减少以及生物膜形成出现障碍。本文发现C.hutchinsonii的LPS缺陷影响了纤维素的降解,并对其机制进行了探讨,这将为进一步阐明C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制提供有力帮助,也将推动对纤维素资源的高效利用。
韩卓[5]（2021）在《维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究》文中研究表明维生素C（Vitamin C,VitC）是人和动物必需的营养物质。科学界对于VitC功能几乎所有的认识都基于它作为电子供体,即作为天然还原剂的化学性质,主要表现在VitC能够清除细胞代谢过程中产生的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,保护重要的生物大分子免于氧化损伤,维持细胞的正常功能。对VitC研究的一次重大突破,在于发现VitC是亚铁离子(ferrous ion,Fe2+)和2-氧戊二酸盐（2-oxoglutarate）依赖型双加氧酶(Fe2+-and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases,Fe2+/2OGDDs)家族关键的“辅因子”,维持Fe2+/2OGDDs在细胞内的活性。进一步研究揭示,VitC能作为辅因子调节Fe2+/2OGDDs家族中与表观修饰有关的酶的催化活性,其中包括DNA羟化酶TET（ten-eleven translocation（TET）family of DNA hydroxylases）和具有Jumonji-C结构域的组蛋白去甲基化酶（Jumonji-C domain-containing histone demethylases）。这一发现直接加速了VitC在干细胞和再生医学领域中的研究,越来越多的证据表明VitC能够通过调控表观修饰酶的活性来提升细胞重编程的效率和质量,也能参与调节干细胞的自我更新和定向分化。有研究曾提出,VitC作为辅因子的生物学功能,本质上依然以VitC固有的还原性为基础,但VitC对表观修饰酶功能调控的特殊性却暗示VitC很可能还存在其他的作用机制,说明我们目前对VitC功能的认识很可能还存在很大空白,大大限制了VitC的应用价值。2014年,本课题组研究发现,VitC通过激活Janus kinase（JAK）2/signal transducer and activator of transcription（STAT）2信号途径,在小鼠胚胎干细胞中诱导Nanog基因的表达。我们曾初步证实,钠离子依赖型VitC转运蛋白2（sodium-dependent vitamin C transporter 2,SVCT2）能够介导VitC对JAK2和STAT2的信号激活,并参与对下游基因的调控,提示VitC与细胞信号转导有关联。在此基础上,本研究以小鼠F9畸胎瘤干细胞系为主要研究对象,首次证明VitC具有“生物信号分子”的作用,完善了对VitC生物学功能的认知。研究可分为两大阶段,第一阶段揭示VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能;第二阶段研究VitC激活的JAK2信号传递途径具有的调控作用及其对VitC生物学功能的补充。主要的研究内容和结果列举如下:1.发现和探究VitC转运蛋白SVCT2的受体功能。首先,通过蛋白质免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）和免疫印迹,我们证明SVCT2特异性结合JAK2而不结合JAK1、JAK3和TYK2。然后,通过基序预测和突变体策略,研究SVCT2蛋白序列中介导JAK2结合和激活的关键结构基序。结果显示,位于SVCT2羧基末端的618-621位氨基酸序列以及连接第8～9号跨膜螺旋的胞质侧肽段中的418-422位氨基酸序列是负责结合JAK2的关键基序,介导VitC对JAK2的激活。通过磷酸化位点预测和突变体策略,研究JAK2对SVCT2潜在的磷酸化作用及其对招募STAT2的影响。结果显示,VitC激活的JAK2催化SVCT2羧基端Tyr626发生磷酸化,介导SVCT2对STAT2的招募,进一步诱导JAK2和STAT2的磷酸化。之后,通过双荧光素酶报告（Dual Luciferase Reporter）实验,我们还证明SVCT2响应VitC处理增强STAT2的转录因子活性,且依赖JAK2的激活。综上,本研究证实SVCT2是VitC的“受体样转运蛋白”,具有JAK2偶联受体的典型特征。此外,本研究还证明VitC对JAK2的激活与VitC在细胞内的积累无关。2.研究SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间的关联。通过co-IP和免疫印迹,研究SVCT2介导的VitC运输对JAK2激活的影响。结果显示,抑制SVCT2对VitC的运输作用会抑制SVCT2对JAK2的磷酸化激活。通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography）实验,研究SVCT2对JAK2的激活是否反过来影响SVCT2对VitC的运输。结果显示,抑制JAK2的激活也会削弱SVCT2对VitC的运输能力。这部分研究证明,SVCT2介导的VitC运输和JAK2信号激活之间紧密偶联、不可分割,是一个完整的生物学事件。3.研究VitC激活JAK2与清除ROS之间的关系。首先,通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）和免疫印迹,研究VitC抑制ROS的作用对激活JAK2的影响。结果显示,VitC对JAK2的激活并不依赖对ROS的抑制。接下来,我们研究VitC激活的JAK2是否反过来影响VitC对ROS水平的调控。结果显示,VitC抑制细胞内ROS的水平且部分依赖JAK2的活性。随后的研究进一步证明,VitC激活的JAK2催化其固有底物脯氨酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase,PDHK1）发生磷酸化,活化的PDHK1又催化脯氨酸脱氢酶E1α亚基（E1 alpha subunit of pyruvate dehydrogenase,PDHA1）Ser232发生磷酸化,抑制PDHA1的活性,降低细胞氧化代谢效率,进而抑制ROS的产生。4.研究JAK2的激活对VitC表观调控功能的影响。通过免疫荧光、点杂交和免疫印迹,研究VitC激活的JAK2对5hm C水平的调控。结果显示,抑制JAK2的激活会抑制VitC对5hm C水平的促进。通过磷酸化位点预测和突变体策略,我们首次证明TET3是JAK2的激酶底物。VitC和SVCT2激活的JAK2直接催化TET3 Tyr1375发生磷酸化。后续研究证实Tyr1375的磷酸化增强了TET3的酶活性并影响其对靶基因的选择,表明VitC不仅仅以辅因子身份调控TET酶的功能。另外,VitC激活的JAK2催化其固有底物组蛋白H3第41位酪氨酸残基发生磷酸化,而后者有利于开放染色质状态的建立。通过微球菌核酸酶消化实验,我们证明VitC确实能够提高基因组DNA的可接近性,且依赖于JAK2的激活。5.研究JAK2的激活对VitC在细胞多能性和分化调控中的影响。通过碱性磷酸酶染色、表达谱m RNA测序和实时定量PCR,研究VitC激活的JAK2对F9细胞的多能性,以及对多能性和分化相关基因表达的影响。结果显示,在F9细胞中,VitC对细胞多能性没有明显影响,但倾向于促进分化发育相关基因（特别是与神经成熟相关基因）的表达,且依赖于JAK2的激活;只有在JAK2活性被抑制的条件下,VitC更倾向于促进细胞的多能性,并诱导一系列多能性相关基因（但不包括Nanog）的表达。进一步的研究发现,VitC激活的JAK2实际上通过两条作用相反的途径分别调控两类下游基因的表达,即通过依赖STAT2的途径调控少数特定多能性相关基因（比如Nanog）的表达;通过不依赖STAT2的途径调控与分化相关基因的表达。综上,本研究发现VitC转运蛋白SVCT2具有JAK2偶联受体的功能,并证明激活JAK2是VitC发挥调控作用的重要途径。这是对VitC生物学作用突破性的发现,为其生理和药理功能的研究带来新的思考,对VitC在疾病治疗和再生医学等众多领域的应用具有一定的指导意义。
董如壮[6]（2021）在《葡萄胚珠特异表达转录因子VvNAC26的功能研究》文中研究表明葡萄（Vitis vinifera L.）作为最重要、最普遍的园艺作物之一,不仅用于鲜食、同时广泛应用于制汁、制干和酿酒等工艺,具有较高的营养和经济价值。而葡萄中的无核品种因其食用方便、肉质紧实等独特优良的商品性状,逐渐成为世界各地鲜食葡萄生产和消费的主要趋势和育种方向。然而,葡萄无核性状相关基因较少,无核性状的形成机制和基因调控网络等方面的研究还有待完善,因此利用转基因技术和酵母双杂交技术,找出葡萄无核相关基因及其互作基因,可以为无核机理的研究提供新的思路和方法,对于创建新的无核葡萄种质资源具有重大意义。课题组前期通过对有核和无核葡萄胚珠发育不同时期的转录组和基因组数据的挖掘和分析发现,VvNAC26在有核无核葡萄胚珠发育的不同时期表达量存在显着性差异,推测该基因可能参与葡萄的胚珠发育过程。在此基础上,本试验进一步研究了VvNAC26基因在不同有核无核葡萄中的表达分析、基因序列分析、启动子活性、基因功能和互作基因等,初步验证了其基因功能,主要研究结果如下:1、VvNAC26基因的表达模式分析。利用q RT-PCR对VvNAC26基因在有核葡萄‘红地球’和无核葡萄‘无核白’葡萄根、茎、叶、花、须、果中表达水平的检测结果表明,VvNAC26基因在‘红地球’和‘无核白’葡萄中表达模式相似,均在果实中表达量最高,且在两个品种的叶片、花和果实三个器官中表达量无显着性差异;对VvNAC26基因在四个有核葡萄‘红地球’、‘巨峰’、‘醉金香’、‘巨玫瑰’与四个无核葡萄‘无核白’、‘费雷无核’、‘碧香无核’、‘克瑞森无核’花后5个胚珠发育关键时期表达水平分析表明,VvNAC26基因在花后20d、27d、34d三个时期内四个无核品种中的表达量显着高于有核品种,在花后41d、49d时,VvNAC26基因在巨玫瑰和红地球中的表达量升高,但依旧低于在费雷无核、无核白、克瑞森无核中的表达量。2、VvNAC26基因的克隆和序列分析。以有核葡萄‘巨峰’‘红地球’和无核葡萄‘费雷无核’、‘无核白’葡萄花后不同时期的胚珠c DNA混合液为模板,扩增得到长849bp的基因序列,分析发现VvNAC26基因位于1号染色体上,含有3个外显子与2个内含子,全长849 bp,编码282个氨基酸,属于NAP亚家族,序列比对发现有核无核不同葡萄品种中VvNAC26基因没有碱基序列差异,与大豆Gm NAC1基因和鹰嘴豆Car NAC3基因具有较高的序列同源性（分别为66.43%和62.81%）亚细胞定位分析发现VvNAC26基因在细胞核中发挥作用。3、启动子克隆与活性分析。参考‘黑比诺’VvNAC26基因启动子序列信息,设计引物,分别在有核葡萄‘红地球’和无核葡萄‘无核白’中克隆得到了长1500 bp的启动子序列,序列分析发现在‘红地球’和‘无核白’的启动子序列中存在四个单碱基差异,但启动子元件数量与种类相同,且包含多个与植物激素相关的顺式作用元件;启动子活性分析发现相同序列长度下启动子活性并无差异,但启动子活性随长度变化而变化,表明不同长度的启动子片段中可能包含潜在的具有正负调控启动子活性变化功能的顺式作用元件。4、VvNAC26过表达载体的构建和遗传转化。构建VvNAC26过表达载体,转化番茄发现转基因株系番茄果实体积变小,颜色更深,叶片颜色较暗,组织学切片观察发现,转基因果实果皮细胞小,种子子叶细胞排列更紧密,细胞狭窄,果实和种子细胞数量也变小。基因定量分析发现,转基因株系中与VvNAC26序列高度相似的番茄基因Sl NAP1、Sl NAC2和负调控CDK活性控制细胞大小的Sl WEE1基因表达水平并未发生变化,但乙烯和ABA相关基因表达水平升高。5、互作蛋白筛选。自激活验证试验发现VvNAC26基因不具有自激活活性且对酵母Y2H菌株生长无毒性作用;酵母双杂交试验找到了5个候选互作蛋白,双分子荧光互补试验进一步验证了VvNAC26和VvMADS9之间存在互作关系。
常伟东[7]（2021）在《拟南芥D1蛋白成熟过程的生理意义研究》文中研究说明光合作用利用太阳能将无机物转换成有机物,为生物圈的形成、发展、繁荣及维持提供了物质基础,被称为“地球上最重要的化学反应”。光合复合体PSⅡ是一个位于类囊体膜上的多亚基蛋白复合体,催化光驱动的水氧化和质体醌还原,在光合电子传递链中起着至关重要的作用。D1蛋白作为PSⅡ复合体的核心,对PSⅡ活性起着决定性的作用。在绝大多数产氧光合生物中,D1蛋白以前体形式（pD1）合成,pD1蛋白的碳末端有一个小肽片段,此小肽片段由碳末端肽酶CTP剪切加工,pD1才能成熟为D1。D1蛋白的成熟是PSⅡ复合体的组装和光损伤修复的关键步骤之一,目前对于D1蛋白剪切成熟的生物学意义以及pD1碳末端小肽的生理功能仍然不清楚。我们分别从CTP蛋白酶和D1蛋白两个方面的实验分析探索了这两个科学问题。首先对产氧光合生物CTP蛋白进行了系统发育树分析,发现真核生物和原核生物的Ctp A源于最近的一个共同祖先,原核生物的Ctp B和CtpC处于同一进化枝,与Ctp A显示更近的关系,而真核生物的Ctp B和CtpC分别处于各自的进化枝,表明Ctp A在原核生物演化的早期就已经与Ctp B和CtpC分开,可能已经产生了较大的功能差异。转录水平分析显示拟南芥三个CTP基因有不同的表达量,更加证实了三者间的功能差异。我们对拟南芥的三个Ctp基因突变体做了进一步分析。AtCtpA（At4g17740）的缺失可以导致植物pD1蛋白积累和致死表型。而AtCtpB（At3g57480）和AtCtpC（At5g46390）两个同源蛋白基因的单独或者共同缺失都不会对植物生长造成任何明显的变化,同样也没有pD1蛋白的积累,似乎只有AtCtpA蛋白承担pD1蛋白成熟的功能。系统发育树将Ctp蛋白家族分成了四个进化枝,我们对代表不同演化程度的模式生物蓝藻Synechococcus elongatus PCC7942、绿藻Chlamydomonas reinhardtii、苔藓Physcomitrella patens和拟南芥的Ctp进行了功能分析,发现蛋白序列相差很大的Ctp A功能是十分保守的,它们都可以将pD1加工成成熟的形式而回复拟南芥AtCtpA缺失致死表型。而所有Ctp B或CtpC蛋白均没有剪切pD1蛋白的功能。我们推测Ctp A应该是在与Ctp B和CtpC分开后的演化过程中形成了剪切pD1的功能,而CtpB和CtpC在整个过程中从未获得此功能。用拟南芥和蓝藻pD1两种底物测试上述四个Ctp A蛋白酶的活性。结果显示高等植物的Ctp A对两种底物均表现最强的剪切活性。这可能是对高光环境D1蛋白光损伤快速周转的一种适应。综上所述,Ctp A是演化过程中唯一获得剪切pD1功能的蛋白酶。为了探究pD1碳末端短肽的生理功能,我们将成熟的D1蛋白与定位于叶绿体基质的转导肽融合,转入AtCtpA缺失突变体中。结果显示定位于叶绿体基质的转导肽可以将核编码的融合D1蛋白转入叶绿体基质中,外源成熟的D1蛋白可以顺利的组装成活性的PSⅡ复合体。与野生型相比,转基因植物没有显着的生长表型差异,光合参数分析显示可以如野生型一样做出相同的光响应,叶绿体内源pD1的合成造成PSⅡ活性略微低于野生型。我们还将成熟的AtCtpA蛋白酶与定位于叶绿体基质的转导肽融合,转入AtCtpA缺失突变体中,叶绿体内源pD1蛋白可以提前成熟,成熟的D1蛋白同样可以顺利的组装成功能性PSⅡ复合体,PSⅡ活性与野生型表现相同的光响应。这说明定位于叶绿体基质的AtCtpA可以在叶绿体基质侧对pD1蛋白进行剪切加工;在叶绿体基质侧成熟的D1蛋白可以行使正常的生理功能。因此,我们推断pD1蛋白碳末端片段在光合作用中并没有重要的生理功能。综合所有数据表明,成熟的D1蛋白是产氧光合生物所必须的,是构成活性PSⅡ复合体的前提,Ctp A可能是产氧生物中唯一有剪切pD1功能的蛋白酶,pD1蛋白碳末端片段在D1的成熟过程中似乎没有生理意义。我们推测原始的PSⅡ拥有一个pD1/D2型非产氧的反应中心,在演化的进程中,Ctp A获得了剪切pD1蛋白碳末端延伸小肽的功能,将pD1/D2型PSⅡ转换成D1/D2型PSⅡ。因此我们认为Ctp A功能的特化可能是产氧生物出现的一个关键因素,pD1蛋白碳末端延伸小肽可能是演化过程中的历史遗留。
赵永[8]（2021）在《蓖麻抗旱性及类受体蛋白激酶功能研究》文中提出目前,干旱是危害蓖麻（Ricinus communis L.）生长发育及其产量的一个重要非生物胁迫因素。研究发现:类受体蛋白激酶（Receptor-like protein kinase,RLKs）在应对植物非生物胁迫过程中起关键作用,植物中的RLKs由胞外受体结构域（ECLB）、跨膜结构域（TM）、胞内激酶域（PKC）组成,通过ECLB感受由环境变化引起的胁迫信号,并将信号传入细胞内,使植物做出应答。蓖麻中含有较多数量的RLKs,但其与干旱胁迫的关系尚不清楚。本研究以蓖麻根系为材料,通过转录组学和蛋白质组学技术,筛选出受干旱胁迫诱导表达的类受体蛋白激酶,并对其抗旱性机制展开研究,结果如下:（1）2017001、2017002、2017003、2017004、2017005 和 2017006 蓖麻品系进行干旱胁迫处理,确定2017005蓖麻品系抗旱能力最强,并对2017005蓖麻品系进行转录组学和蛋白质组学研究。PEG-6000处理2017005蓖麻植株3 d至7 d时,根系中H2O2和MDA产生速率随胁迫时间延长呈升高趋势,同时POD、GR、APX和CAT等抗氧化酶活性也表现出升高趋势。（2）利用RNA-seq对PEG-6000胁迫下的蓖麻根系进行转录组学分析,胁迫3 d时筛选出2926个差异基因（DEGs）,7 d时筛选出1516个DEGs,复水4 d时筛选出1 1 1个DEGs。GO分析表明:DEGs主要富集在胁迫响应、信号传递、抗氧化等生物学过程。KEGG pathway分析表明:DEGs参与的主要代谢途径,包括:苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、二萜类生物合成、植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、光合生物碳固定。（3）利用iTRAQ对PEG-6000胁迫下的蓖麻根系进行蛋白质组学分析,胁迫3 d时筛选出318个差异蛋白质（DAPs）,7 d时筛选出190个DAPs,复水4 d时筛选出100个DAPs。COG功能富集分析发现:DAPs可分为20类,其中数量最多的DAPs主要参与蛋白质的合成和修饰,其次是参与碳水化合物代谢、细胞内物质运输、次生产物的合成及分解代谢。同时利用KEGG pathway分析发现:DAPs主要参与碳水化合物代谢、苯丙烷生物合成、萜类骨架的生物合成、类黄酮生物合成、植物激素信号转导、氨基酸的合成与分解代谢。（4）对蓖麻根系转录组学和蛋白质组学进行关联分析,共获得95个差异基因,其中大部分DEGs与DAPs正相关,但表达丰度存在差异。转录组学和蛋白质组学关联分析表明:差异基因参与的代谢途径主要包括:碳水化合物代谢、苯丙烷生物合成代谢、类黄酮生物合成代谢、氧化磷酸化代谢、氨基酸合成和分解代谢。以上结果表明:蓖麻在受到干旱胁迫时,除了初级代谢参与应答胁迫外,次级代谢在蓖麻胁迫应答过程中也起到关键作用。（5）基于组学数据筛选出4个类受体蛋白激酶基因（SPKATPK2、CDPK33、CDPK26和SPKBSK7）,在PEG-6000胁迫下基因表达量均发生了改变。对4个基因的亚细胞定位进行分析,结果表明:SPKATPK2、CDPK33和CDPK26定位于细胞核和细胞膜,而SPKBSK7定位于细胞核、细胞膜和细胞质。同时对4个基因的过表达拟南芥植株抗旱性进行研究,结果表明:SPKBSK7-3转基因拟南芥植株的抗旱能力最强,同时对ABA和甘露醇胁迫较为敏感,而且SPKBSK7基因的过表达蓖麻植株与野生型相比具有更强的抗旱能力。此外通过酵母双杂交筛选到与SPKBSK7蛋白质相互作用的SAP3蛋白质,并测定两个蛋白质的亲和力为KD=18.8 nM,因此推测SPKBSK7过表达蓖麻植株的抗旱能力,主要是SPKBSK7与SAP3相互作用的结果,从而增强了蓖麻对干旱胁迫的耐受性。
朱凯杰[9]（2020）在《脐橙果皮色泽变异及番茄红素β-环化酶的调控研究》文中提出叶绿素降解和类胡萝卜素积累是很多园艺植物果实成熟的必经过程,对果实的色泽品质起决定性作用。果实叶绿素和类胡萝卜素含量的差异使其呈现出绿色、红色、橙色、黄色、甚至棕色等。近年来,尽管我们对叶绿素降解和类胡萝卜素合成途径有了较多的研究,但关于这两条代谢途径协同调控的分子机制仍然未知。本研究以新发掘的脐橙果皮色泽突变体‘宗橙’为材料,对其棕色果皮表型及其主要品质性状进行了精细分析,采用多组学和多种遗传资源整合策略挖掘到其突变位点,并结合生化手段解析了该突变体果皮叶绿素降解受阻和类胡萝卜素积累增加的突变机制。同时探究了柑橘红色性状形成关键基因——有色体特异表达番茄红素β-环化酶（LCYb2）的等位基因酶活差异,筛选到直接调控CsLCYb2的关键转录因子,并对它们进行了系统地功能分析。主要研究结果如下:1.脐橙果皮棕色变异‘宗橙’的表型及其突变机制‘宗橙’是在湖北省宜昌市秭归县归州镇‘伦晚脐橙’果园里发现的一个果皮色泽芽变,经过选育成为新品种,其果皮呈现独特的棕色。对‘宗橙’果实常规生理指标测定发现,其果皮色差、硬度和香气与‘伦晚脐橙’不同,而其余果实品质则相同。‘宗橙’成熟果实有色层中叶绿素滞留,且类胡萝卜素积累增加,说明棕色果实形成的代谢基础是由于有色层中叶绿素和类胡萝卜素同时积累所致。‘宗橙’有色层中ABA和JA含量均显着高于‘伦晚脐橙’。破色期后‘宗橙’果实有色层中叶绿体降解受阻,至成熟期仍存在大量叶绿体,且成熟期‘宗橙’果实有色体数目相比对照明显增多,而淀粉颗粒明显减少,淀粉含量显着下降。GS-MS分析表明‘宗橙’和‘伦晚脐橙’果实有色层中大量初生和挥发性代谢物存在显着差异。采后贮藏实验发现,贮藏期间‘宗橙’果实品质总体上较‘伦晚脐橙’差。青霉菌接种侵染实验表明,相比‘伦晚脐橙’,‘宗橙’果实对青霉菌抗性更弱。通过整合多组学和和多种遗传资源的策略鉴定到了‘宗橙’的突变基因——滞绿基因STAY-GREEN（SGR）。测序发现柑橘中SGR基因存在两个等位基因（CsSGRa和CsSGRb）,与CsSGRa相比,CsSGRb由于序列变异引起的选择性剪接而提前终止,产生截短型蛋白。‘宗橙’中CsSGRa编码区的两个连续碱基发生替换形成终止密码子,使得蛋白编码提前终止(命名为CsSGRa STOP),而CsSGRb基因序列与野生型一致。烟草瞬时表达实验发现仅CsSGRa具有叶绿素降解活性,CsSGRa STOP和CsSGRb均丧失了降解叶绿素的功能,这导致了‘宗橙’果实中叶绿素无法降解。工程菌和柑橘愈伤组织转基因实验表明,CsSGRa和CsSGRb均能抑制类胡萝卜素合成,而CsSGRa STOP不具备抑制活性;Bi FC和Y2H实验证实CsSGRa和CsSGRb可直接与类胡萝卜素途径关键限速酶CsPSY1互作,而CsSGRa STOP与CsPSY1不互作;上述结果表明‘宗橙’中CsSGRa STOP通过解除对CsPSY1的抑制作用促进了类胡萝卜素的合成,使得果实中类胡萝卜素含量增加。因此,CsSGRa的变异是宗橙果皮叶绿素降解受阻、类胡萝卜素含量显着增加的直接原因,绿色和橙色叠加使其最终呈现出棕色表型。2.甜橙CsLCYb2及其互作转录因子在果实色泽形成中的功能有色体特异性LCYb2是类胡萝卜素代谢途径的关键酶,本研究在番茄中超表达2个甜橙LCYb2等位基因（CsLCYb2a和CsLCYb2b）,产生了富含β-胡萝卜素的金色番茄果实。在CsLCYb2a超表达系番茄果实中,β-胡萝卜素增加了9.3倍（1.5 mg/g干重）,且未检测到番茄红素;而在CsLCYb2b超表达系番茄果实中,β-胡萝卜素也显着增加,番茄红素显着减少但未消失;这些结果说明甜橙CsLCYb2等位基因的酶活性存在差异。进一步以CsLCYb2的启动子为诱饵进行酵母单杂筛库,成功筛选到了调控CsLCYb2的2个关键候选转录因子CsMADS3和CsERF061。CsMADS3是MADS-Box家族基因。基因表达和蛋白丰度分析表明,CsMADS3的表达水平与果实发育和色泽形成密切相关。CsMADS3是核定位的转录激活因子,能直接结合并激活CsLCYb2启动子。CsMADS3在柑橘愈伤组织中的超表达显着促进了类胡萝卜素的积累以及大部分类胡萝卜素代谢途径基因的表达,并改变了有色体的形态和激素含量。超表达CsMADS3的番茄转基因系,其果实加速褪绿且类胡萝卜素积累增加,叶绿素降解和类胡萝卜素生物合成途径中关键基因上调表达,有色体和激素显着变化。生化实验证明CsMADS3能结合并激活SGR及8个类胡萝卜素途径关键基因的启动子,包括PSY、PDS、CRTISO、BCH、ZEP、NCED、CCD1、CCD4。表明CsMADS3具有多靶点调控特性,在叶绿素降解和类胡萝卜素合成的协同调控中发挥作用。CsERF061属于乙烯响应因子家族的I亚族,其表达受乙烯诱导,且与果实成熟和着色高度相关。CsERF061是一个核定位的转录激活因子,能直接结合并激活CsLCYb2启动子。在柑橘愈伤组织和番茄果实中超表达CsERF061基因,均发现类胡萝卜素含量显着增加,类胡萝卜素代谢途径关键基因的表达上调,并伴随着有色体和激素含量的变化。生化实验证明CsERF061还能激活其它9个类胡萝卜素途径关键基因的启动子,包括PSY、PDS、CRTISO、LCYb1、BCH、ZEP、NCED、CCD1、CCD4。表明CsERF061能在乙烯介导下直接调控类胡萝卜素代谢。综上,本研究阐明了‘宗橙’突变的分子机制,揭示了SGR在调控柑果类果实成熟过程中的重要作用,并首次发现柑橘中SGR等位基因的功能分化及其在调控果实成熟过程中叶绿素降解和类胡萝卜素合成上的独特而精细的调控机制。同时明晰了CsLCYb2等位基因酶活差异,揭示了CsLCYb2互作调控因子CsMADS3对果实成熟过程中叶绿素降解和类胡萝卜素合成的协同调控作用,以及CsERF061在乙烯介导的类胡萝卜素代谢调控中的功能。该研究为未来深入解析柑果类果实叶绿素和类胡萝卜素代谢的协同调控机制奠定了基础。
董川[10]（2020）在《抗CRISPR-Cas蛋白的生物信息学分析与识别研究》文中进行了进一步梳理2013年,Bondy-Denomy等人首次发现了一类小分子蛋白,噬菌体和其它可移动分子可以借此逃脱细菌和古菌CRISPR-Cas系统的免疫伤害。这些蛋白可采用直接结合的方式、位点修饰的方式抑制Cas蛋白的活性,根据该类蛋白抑制CRISPRCas系统的特性,Bondy-Denomy等人将其命名为抗CRISPR-Cas蛋白,简称Acrs。本文的主要工作围绕Acrs进行。本工作从相关文章收集了目前已经报道的Acrs数据,并从相关资源库中收集了Acrs相关的信息。例如,本文从NCBI中收集了Acrs的物种来源、编码基因,从STRING（https://string-db.org/）、DIP（http://dip.doe-mbi.ucla.edu/）等数据库中收集了蛋白的相互作用信息,从毒力因子数据库VFDB（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）中收集了Acrs与毒力因子的序列相似性信息。进一步汇总这些信息,构建了一个在线、综合的数据库Anti-CRISPRdb（http://cefg.uestc.cn/anti-CRISPRdb2）,其中包括400多条记录。随着时间推移,越来越多的Acrs及其家族被发现,于是我们更新了第一个版本的数据库,可以从链接http://cefg.uestc.cn/anti-CRISPRdb/访问。更新版本中包含更多的家族和家族成员信息,新增加了6种抑制类型的Acrs;新版本将NCBI基因组浏览器整合进来,用户可以借此查看Acrs周边蛋白的情况;本工作通过将Acrs和PDB数据库（https://www.rcsb.org/）中的所有蛋白质链进行比对,进而增添了更多的结构信息,其中包括320多个Acrs结构信息。本文工作又基于Anti-CRISPRdb数据库进一步分析了Acrs的特征,分析表明Acrs和非Acrs有明显可区分的特征,具体表现在:Acrs比非Acrs短很多,并且比非Acrs具有更显着的密码子使用偏差,原核生物基因组内大量的Acrs被注释为假设蛋白、功能未知蛋白。本文工作通过分析也发现Acrs演化上的一些特点:1)Acrs多数位于基因组岛和前噬菌体片段上表明了Acrs的水平转移事件;2)Acrs相对于基因组的密码子使用偏差表明Acrs是近期转入到宿主菌中;3)有些Acrs在邻近的物种间连续分布表明了某些Acrs近期的转入事件,并在近邻物种间进行了扩张。为了定量刻画基因位于基因组岛或者前噬菌体片段上的可能性,本文工作定义并提出了一个无序列比对的参数dev,该参数是基于基因密码子相对于基因组密码子使用偏差进行的度量。基于Acrs的特征和演化上的特点,本文工作又构建了基于随机森林的识别算法。多次不同随机状态下的交叉验证表明该方法可以获得平均99.75%的准确率、平均75.1%的召回率、平均86.1%的查准率,跨物种交叉验证表明该方法可以将71.4%的真正的Acrs排在预测结果的前10名,该算法也能从新近识别Acrs的物种中准确识别出4个Acrs。基于本文的Acrs识别算法,本论文工作设计了一个网络服务,与此同时也在Git Hub上发布了本地版本,并将其命名为Acr Detector（http://cefg.uestc.cn/acr Detector）。Acr Detector不依赖于同源搜索,因此可以发现新的Acrs。另外,Acr Detector依赖于基因组背景特征,可以作为其它基于序列组成特征的补充工具。虽然Acr Detector可以识别潜在的Acrs,但是却不能识别它所抑制的CRISPRCas系统类型,准确识别候选物种CRISPR-Cas系统类型是识别Acrs抑制类型的关键。为此,本工作将马尔可夫图聚类算法和延伸最大连续Cas子簇的方法引入到Cas蛋白、cas基因座和基因座类型的注释中,这使得本工作的方法可以识别融合的Cas蛋白,并可以识别更加精确的cas基因座。此外,本论文工作也开发了Cas Locus Anno工具（http://cefg.uestc.cn/Cas Locus Anno/index.html）用于Cas蛋白、cas基因座和类型的注释,将并行运算运用到Cas Locus Anno工具中,以便加速注释速度。本文工作测试了Cas Locus Anno的执行效率和识别能力,对于大部分的测试数据Cas Locus Anno可以在29秒内完成注释,大部分物种可以在27.5秒以内的时间完成注释,Cas Locus Anno和CRISPRCas Finder的比较结果表明Cas Locus Anno的准确性比CRISPRCas Finder高出5%,且附加预测率要比CRISPRCas Finder低1.4%。
二、利用NCBI相关资源电子定位基因的方法和实践（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用NCBI相关资源电子定位基因的方法和实践（论文提纲范文）
（1）基于NCBI数据库的高中生物学课程资源开发与利用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 高中生物学课程资源的国内外研究进展 |
| 1.2.2 生物信息数据库在高中生物学教学中的国内外研究进展 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究重难点及创新点 |
| 1.5.1 研究重难点 |
| 1.5.2 研究创新点 |
| 1.6 研究方法和技术路线 |
| 1.6.1 研究方法 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 相关概念界定与理论基础 |
| 2.1 相关概念界定 |
| 2.1.1 生物课程资源 |
| 2.1.2 生物课程资源的开发与利用 |
| 2.1.3 NCBI数据库 |
| 2.2 理论基础 |
| 2.2.1 认知学习理论 |
| 2.2.2 多元化智能理论 |
| 2.2.3 建构主义学习理论 |
| 第3章 高中生物学开发与利用课程资源的现状调查 |
| 3.1 调查概况 |
| 3.1.1 调查目的与调查内容 |
| 3.1.2 调查对象 |
| 3.1.3 问卷的发放与信效度检测 |
| 3.2 高中生物学课程资源开发与利用现状的调查结果分析 |
| 3.2.1 教师的生物课程资源开发利用情况分析 |
| 3.2.2 教师以生物信息数据库作为课程资源开发利用情况分析 |
| 3.3 问卷调查小结 |
| 第4章 基于NCBI数据库的高中生物学课程资源的开发 |
| 4.1 生物信息数据库简介 |
| 4.2 NCBI数据库资源优势 |
| 4.3 NCBI数据库课程资源的开发 |
| 4.3.1 NCBI数据库课程资源的开发原则 |
| 4.3.2 NCBI数据库课程资源的开发成果 |
| 第5章 基于NCBI数据库开发成果的高中生物学教学案例 |
| 5.1 “蛋白质是生命活动的主要承担者”教学案例 |
| 5.1.1 教学背景 |
| 5.1.2 教学目标设计 |
| 5.1.3 教学过程 |
| 5.2 “基因在染色体上”教学案例 |
| 5.2.1 教学背景 |
| 5.2.2 教学目标设计 |
| 5.2.3 教学过程 |
| 5.3 “人类遗传病”教学案例 |
| 5.3.1 教学背景 |
| 5.3.2 教学目标设计 |
| 5.3.3 教学过程 |
| 第6章 基于NCBI数据库开发成果的评价与分析 |
| 6.1 教师对开发成果的评价与分析 |
| 6.1.1 问卷设计 |
| 6.1.2 问卷调查结果与评价分析 |
| 6.2 学生对开发成果的评价与分析 |
| 6.2.1 课堂教学评价量表设计与实验对象选择 |
| 6.2.3 调查结果与分析 |
| 第7章 主要结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 高中生物课程资源开发利用现状调查问卷（教师） |
| 附录2 基于NCBI数据库的高中生物学课程资源利用效果调查问卷 |
| 附录3 NCBI数据库辅助高中生物课堂效果评价量表 |
| 附录4 “遗传与进化”模块中应用 NCBI 数据库课程资源的教学思路 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）水稻抗白叶枯病基因x349的精细定位和两个类病斑早衰突变体基因的图位克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 水稻白叶枯病与病原菌 Xoo |
| 1.1.1 白叶枯病概述 |
| 1.1.2 Xoo的分泌系统与效应因子 |
| 1.1.3 植物-病原菌互作 |
| 1.1.4 植物先天免疫系统 |
| 1.2 水稻抗白叶枯病基因研究进展 |
| 1.2.1 NBS-LRR类抗病基因 |
| 1.2.2 相关激酶类抗病基因 |
| 1.2.3 Executor类抗病基因 |
| 1.2.4 SWEET基因家族类抗病基因 |
| 1.2.5 隐性抗病基因 |
| 1.3 类病斑突变体概述 |
| 1.4 类病斑发生的机制 |
| 1.4.1 抗病相关基因突变 |
| 1.4.2 代谢相关途径紊乱 |
| 1.4.3 ROS积累 |
| 1.4.4 激素水平失衡 |
| 1.4.5 细胞PCD失控 |
| 1.4.6 转录因子功能异常 |
| 1.4.7 非生物因素胁迫 |
| 1.5 植物衰老的机制 |
| 1.6 衰老相关基因的类型 |
| 1.7 CYP71P1 蛋白的生物学功能 |
| 第二章 水稻抗白叶枯病基因 x349 的精细定位 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻材料 |
| 2.1.2 定位群体的构建 |
| 2.1.3 鉴定菌株 |
| 2.1.4 培养基及其它试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 白叶枯病菌的培养、接种、鉴定 |
| 2.2.2 Indel引物设计 |
| 2.2.3 水稻基因组DNA的提取 |
| 2.2.4 PCR扩增 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 突变体x349 的抗谱分析 |
| 2.3.2 抗性遗传分析 |
| 2.3.3 x349 的精细定位 |
| 2.3.4 候选基因分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 抗白叶枯病新基因 |
| 2.4.2 定位区间候选基因的分析 |
| 第三章 两个水稻类病斑早衰突变体的图位克隆 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 水稻材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 表型鉴定 |
| 3.2.2 遮光实验 |
| 3.2.3 组织化学分析 |
| 3.2.4 生理指标的测定 |
| 3.2.5 光合色素含量测定 |
| 3.2.6 透射电镜观察 |
| 3.2.7 水稻基因组 DNA 的提取 |
| 3.2.8 RNA的提取与反转录 |
| 3.2.9 实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析 |
| 3.2.10 msl-1、msl-2 的精细定位 |
| 3.2.11 候选基因分析 |
| 3.2.12 氨基酸序列比对和进化关系分析 |
| 3.2.13 蛋白质三维空间结构分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 突变体表型鉴定 |
| 3.3.2 类病斑突变体的光诱导反应 |
| 3.3.3 突变体的细胞程序性死亡和活性氧积累 |
| 3.3.4 突变体的叶片早衰 |
| 3.3.5 突变体的ROS异常 |
| 3.3.6 msl-1、msl-2 的精细定位 |
| 3.3.7 msl-1、msl-2 的候选基因分析 |
| 3.3.8 表达模式分析 |
| 3.3.9 msl-1、msl-2 编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 msl-1、msl-2 属于扩展型类病斑 |
| 3.4.2 不同的突变方式导致不同的突变表型 |
| 3.4.3 CYP71P1 突变导致早衰 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 山桐子的研究进展 |
| 1.2.1 山桐子概述 |
| 1.2.2 国内外山桐子研究现状 |
| 1.3 植物油脂的生物合成 |
| 1.3.1 植物油脂的合成步骤 |
| 1.3.2 植物油脂合成相关基因的研究进展 |
| 1.4 植物功能基因的研究方法 |
| 1.4.1 基因测序技术 |
| 1.4.2 基因克隆技术 |
| 1.4.3 植物基因的功能验证 |
| 1.5 植物的遗传转化方法 |
| 1.6 本研究的目的意义与研究内容 |
| 1.6.1 目的意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 山桐子果实发育过程中油脂含量及脂肪酸组分的动态变化 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 山桐子果实油脂的提取 |
| 2.1.4 山桐子果实脂肪酸组分的测量 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 山桐子果实的含油率 |
| 2.2.2 山桐子果实的脂肪酸组分 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 山桐子果实发育过程中油脂含量的动态变化 |
| 2.3.2 山桐子果实发育过程中酸组分的动态变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 山桐子果实转录组分析及油脂合成相关基因的挖掘 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 山桐子果实RNA的提取及检测 |
| 3.1.4 cDNA文库构建及转录组测序 |
| 3.1.5 转录组数据的过滤及从头组装 |
| 3.1.6 Unigene的功能注释 |
| 3.1.7 Unigene的差异表达检测 |
| 3.1.8 差异表达Unigene的Pathway功能分析 |
| 3.1.9 q-PCR分析验证转录组测序准确性 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA质量检测 |
| 3.2.2 转录组数据分析及组装 |
| 3.2.3 山桐子Unigene的功能注释 |
| 3.2.4 山桐子差异表达基因分析 |
| 3.2.5 山桐子差异表达基因的功能注释 |
| 3.2.6 参与山桐子油脂合成基因的鉴定 |
| 3.2.7 转录组测序的q-PCR验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 山桐子油脂的生物合成模型 |
| 3.3.2 参与山桐子脂肪酸合成的关键基因 |
| 3.3.3 参与山桐子TAG合成的关键基因 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的克隆及表达分析 |
| 4.1 试验材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 山桐子果实RNA的提取及检测 |
| 4.1.5 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因核心序列的克隆 |
| 4.1.6 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因全长序列的克隆 |
| 4.1.7 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的生物信息学分析 |
| 4.1.8 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的全长序列 |
| 4.2.2 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的生物信息学分析 |
| 4.2.3 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的基本信息 |
| 4.3.2 山桐子不饱和脂肪酸合成相关基因的表达模式 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 山桐子亚油酸合成关键基因Ip FAD2 和Ip DGAT2 的功能分析 |
| 5.1 试验材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要仪器和试剂 |
| 5.1.3 引物设计 |
| 5.1.4 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因表达载体的构建 |
| 5.1.5 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的原核表达 |
| 5.1.6 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的真核表达 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 山桐子Ip FAD2 和Ip DGAT2 基因的的原核表达 |
| 5.2.2 山桐子Ip FAD2 基因的的真核表达 |
| 5.2.3 山桐子Ip DGAT2基因的的真核表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 山桐子Ip FAD2 基因的功能验证 |
| 5.3.2 山桐子Ip DGAT2基因的功能验证 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 山桐子遗传转化受体系统的建立 |
| 6.1 试验材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 主要仪器和试剂 |
| 6.1.3 叶片愈伤组织再生体系的建立 |
| 6.1.4 愈伤组织的抗生素敏感性试验 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 叶片的消毒与灭菌 |
| 6.2.2 愈伤组织的诱导 |
| 6.2.3 愈伤组织的继代 |
| 6.2.4 不定芽的诱导 |
| 6.2.5 不定芽的复壮 |
| 6.2.6 抗生素敏感性 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 山桐子叶片愈伤组织再生体系 |
| 6.3.2 山桐子叶片愈伤组织的抗生素敏感性 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）哈氏噬纤维菌LPS合成相关基因chu2177、chu2178、chu1927、chu2532和chu3392的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 纤维素资源的开发和利用 |
| 1.2 木质纤维素 |
| 1.3 降解纤维素的微生物 |
| 1.4 微生物降解纤维素的策略 |
| 1.5 脂多糖 |
| 1.5.1 脂多糖的结构 |
| 1.5.2 脂多糖的合成 |
| 1.6 IX型分泌系统 |
| 1.7 Cytophaga hutchinsonii的研究背景 |
| 1.7.1 C.hutchinsonii的系统发育 |
| 1.7.2 C. hutchinsonii的研究进展 |
| 1.8 论文的立题依据和工作思路 |
| 第二章 在C. hutchinsonii中插入突变筛选菌株以及部分基因的缺陷菌株的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器和试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 分子生物学反应体系 |
| 2.1.6 C. hutchinsonii感受态的制备 |
| 2.1.7 C. hutchinsonii的电击转化 |
| 2.1.8 转座子插入突变 |
| 2.1.8.1 筛选滤纸降解缺陷菌株 |
| 2.1.8.2 转座子插入位点的鉴定 |
| 2.1.9 E.coli感受态的制备 |
| 2.1.10 E.coli热激转化 |
| 2.1.11 基因敲除 |
| 2.1.12 滤纸降解实验 |
| 2.1.13 软琼脂扩散实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 筛选滤纸降解缺陷株 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.3 基因敲除株的构建及表型验证 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 chu_2177和chu_2178的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 主要仪器和试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 分子生物学反应体系 |
| 3.1.6 C.hutchinsonii感受态的制备和电击转化 |
| 3.1.7 E.coli感受态的制备和热激转化 |
| 3.1.8 基因回补 |
| 3.1.8.1 pTKS3328的构建 |
| 3.1.8.2 启动子的替换 |
| 3.1.8.3 突变株的回补 |
| 3.1.9 滤纸降解实验 |
| 3.1.10 软、硬琼脂扩散实验 |
| 3.1.11 再生无定形纤维素(RAC)的制备 |
| 3.1.12 生长曲线的测定 |
| 3.1.12.1 以葡萄糖或纤维二糖为碳源的生长曲线 |
| 3.1.12.2 以RAC或Avicel为碳源的生长曲线 |
| 3.1.12.3 蛋白浓度的测定(考马斯亮蓝法) |
| 3.1.13 生物信息学分析 |
| 3.1.14 LPS的提取 |
| 3.1.15 LPS的电泳与银染 |
| 3.1.16 纤维素酶活的测定 |
| 3.1.17 纤维素吸附率测定 |
| 3.1.18 扫描电子显微镜(SEM)观察菌体在滤纸纤维上的排布 |
| 3.1.19 细胞各组分蛋白的提取 |
| 3.1.19.1 外膜蛋白的提取 |
| 3.1.19.2 外膜吸附蛋白的提取 |
| 3.1.19.3 胞外蛋白的提取 |
| 3.1.19.4 周质空间蛋白的提取 |
| 3.1.20 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 3.1.21 蛋白免疫印迹杂交(Western blot) |
| 3.1.21.1 利用CHU_1336抗体检测的Western blot |
| 3.1.21.2 利用生物素化凝集素检测的Western blot |
| 3.1.22 纤维素内切酶酶活的复性电泳 |
| 3.1.23 生物膜 |
| 3.1.24 胞外多糖的检测 |
| 3.1.25 细胞抗逆能力的测定 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 生物信息学分析 |
| 3.2.1.1 CHU_2176的生物信息学分析 |
| 3.2.1.2 CHU_2177的生物信息学分析 |
| 3.2.1.3 CHU_2178的生物信息学分析 |
| 3.2.1.4 相互作用蛋白的分析 |
| 3.2.2 基因敲除 |
| 3.2.3 chu_2176、chu_2177、chu_2178和chu_0602参与LPS的合成 |
| 3.2.4 chu_2176、chu_2177、chu_2178对纤维素降解的影响 |
| 3.2.5 chu_2176、chu_2177、chu_2178对菌体运动的影响 |
| 3.2.6 chu_2177、chu_2178对结晶纤维素降解的影响 |
| 3.2.7 chu_2177、chu_2178对纤维素吸附能力的影响 |
| 3.2.7.1 菌体对纤维素的吸附 |
| 3.2.7.2 外膜蛋白对纤维素的吸附 |
| 3.2.8 chu_2177、chu_2178对纤维素酶酶活的影响 |
| 3.2.8.1 纤维素酶酶活的测定 |
| 3.2.8.2 内切纤维素酶的复性电泳 |
| 3.2.9 chu_2177、chu_2178对外膜和胞外蛋白的影响 |
| 3.2.9.1 Δ2177、Δ2178的外膜和胞外的差异蛋白 |
| 3.2.9.2 Δ2177、Δ2178的外膜糖基化蛋白的检测 |
| 3.2.9.3 Δ2177、Δ2178的CTD蛋白定位 |
| 3.2.10 chu_2177、chu_2178对胞外多糖的影响 |
| 3.2.11 chu_2177、chu_2178对生物膜的影响 |
| 3.2.12 chu_2177、chu_2178对抗逆性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 chu_1927、chu_2532和chu_3392的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌种和质粒 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 主要仪器和试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 分子生物学反应体系 |
| 4.1.6 C.hutchinsonii感受态的制备和电击转化 |
| 4.1.7 E.coli感受态的制备和热激转化 |
| 4.1.8 基因回补 |
| 4.1.9 滤纸降解实验 |
| 4.1.10 软、硬琼脂扩散实验 |
| 4.1.11 再生无定形纤维素(RAC)的制备 |
| 4.1.12 生长曲线的测定 |
| 4.1.13 生物信息学分析 |
| 4.1.14 LPS的提取 |
| 4.1.15 LPS的电泳与银染 |
| 4.1.16 纤维素酶活的测定 |
| 4.1.17 纤维素吸附率测定 |
| 4.1.18 扫描电子显微镜(SEM)观察菌体在滤纸纤维上的排布 |
| 4.1.19 外膜蛋白的提取 |
| 4.1.20 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 4.1.21 生物膜 |
| 4.1.22 胞外多糖的检测 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 生物信息学分析 |
| 4.2.1.1 CHU_1927的生物信息学分析 |
| 4.2.1.2 CHU_2532的生物信息学分析 |
| 4.2.1.3 CHU_3392的生物信息学分析 |
| 4.2.2 基因敲除 |
| 4.2.3 chu_1927、chu_2532、chu_3392参与LPS的合成 |
| 4.2.4 chu_1927、chu_2532、chu_3392参与纤维素的降解 |
| 4.2.5 chu_1927、chu_2532、chu_3392对菌体运动的影响 |
| 4.2.6 chu_1927、chu_2532、chu_3392对结晶纤维素降解能力的影响 |
| 4.2.7 chu_1927、chu_2532、chu_3392对纤维素吸附能力的影响 |
| 4.2.8 chu_1927、chu_2532、chu_3392对纤维素酶酶活的影响 |
| 4.2.9 chu_1927、chu_2532、chu_3392对外膜蛋白的影响 |
| 4.2.10 chu_1927、chu_2532、chu_3392对生物膜的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 全文总结 |
| 前景展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 维生素C性质及其生物学功能的研究进展 |
| 1.1.1 维生素C的发现、生物合成及利用 |
| 1.1.2 维生素C的运输及机体稳态调节 |
| 1.1.3 维生素C的抗氧化性 |
| 1.1.4 维生素C是二价铁离子和α-氧戊二酸盐依赖性双加氧酶家族蛋白的关键辅因子 |
| 1.1.5 维生素C促进细胞重编程 |
| 1.1.6 维生素C是一个低甲基化诱导因子 |
| 1.1.7 维生素C的潜在抗癌机制 |
| 1.1.8 维生素C与其他疾病的关系及潜在治疗作用 |
| 1.1.9 维生素C在调控细胞信号通路方面的初探索 |
| 1.1.10 维生素C已知的生物学功能具有两面性 |
| 1.2 钠离子依赖型维生素C转运蛋白SVCTs的研究进展 |
| 1.2.1 SVCTs的结构、定位和运输作用 |
| 1.2.2 SVCT1和SVCT2 表达和功能的调控 |
| 1.2.3 SVCT2 在调控细胞分化和细胞功能成熟中的作用 |
| 1.3 非受体型酪氨酸激酶JAK2 的研究进展 |
| 1.3.1 JAK激酶家族蛋白的结构和功能简介 |
| 1.3.2 JAK2 激酶活性的调控 |
| 1.3.3 非经典细胞核内JAK2 信号转导途径研究进展 |
| 第二章 维生素C转运蛋白SVCT2 受体功能的探究 |
| 2.1 材料、试剂与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 2.1.6 细胞培养 |
| 2.1.7 真核表达载体构建 |
| 2.1.8 细胞转染 |
| 2.1.9 免疫印迹 |
| 2.1.10 蛋白质免疫(共)沉淀(Immunoprecipitation (IP)/co-Immunoprecipitation (co-IP)) |
| 2.1.11 总RNA提取、反转录和实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR) |
| 2.1.12 双荧光素酶报告实验(Dual Luciferase Reporter Assay,DLR) |
| 2.1.13 细胞内VitC含量测定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SVCT2 响应VitC处理特异性激活JAK2和STAT2 |
| 2.2.2 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导与JAK2 的互作 |
| 2.2.3 SVCT2 羧基端和连接第 8~9 号跨膜螺旋间的胞质侧肽段介导对JAK2 的磷酸化激活 |
| 2.2.4 VitC对 JAK2 的激活与VitC的胞内积累无关且呈现振荡性 |
| 2.2.5 VitC诱导SVCT2 Tyr~(626)发生磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.6 SVCT2 Tyr626的磷酸化介导对 STAT2 的招募 |
| 2.2.7 SVCT2 响应VitC处理增强STAT2 的转录因子活性 |
| 2.2.8 SVCT2对JAK2 的激活依赖对VitC的运输 |
| 2.2.9 SVCT2对VitC的充分运输依赖JAK2 的激活 |
| 2.2.10 DHA和 GLUT1/3 不能激活JAK2/STAT2 信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 VitC激活的JAK2 信号途径调节细胞内ROS的水平 |
| 3.1 材料、试剂与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与耗材 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 3.1.6 细胞培养 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 免疫印迹 |
| 3.1.9 细胞内ROS含量测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VitC对 JAK2 的激活与对 ROS的抑制无关 |
| 3.2.2 VitC抑制ROS的水平且部分依赖JAK2 的激活 |
| 3.2.3 激活JAK2 有助于SVCT2对ROS的抑制 |
| 3.2.4 VitC诱导PDHK1和PDHA1 的磷酸化且依赖JAK2 的活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞表观调控 |
| 4.1 材料、试剂与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与耗材 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 4.1.6 细胞培养 |
| 4.1.7 真核表达载体构建 |
| 4.1.8 细胞转染 |
| 4.1.9 免疫印迹 |
| 4.1.10 IP/co-IP |
| 4.1.11 5mC和5hmC免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)实验 |
| 4.1.12 点杂交(dot blot,DB)实验 |
| 4.1.13 微球菌核酸酶消化实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 VitC诱导F9 细胞基因组5hm C的积累且部分依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.2 VitC激活的JAK2 催化 TET3 Tyr~(1375)发生磷酸化 |
| 4.2.3 Tyr~(1375)的磷酸化提高TET3 的酶活性 |
| 4.2.4 VitC诱导组蛋白H3 Tyr~(41)的磷酸化且依赖JAK2 的激活 |
| 4.2.5 VitC提高F9 细胞DNA的可接近性且依赖JAK2 的激活 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 VitC激活的JAK2 信号途径参与细胞多能性和分化调控 |
| 5.1 材料、试剂与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与耗材 |
| 5.1.4 主要试剂配方 |
| 5.1.5 主要分析软件和数据库 |
| 5.1.6 细胞培养 |
| 5.1.7 细胞转染 |
| 5.1.8 免疫印迹 |
| 5.1.9 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色实验 |
| 5.1.10 总RNA提取、反转录和RT-q PCR |
| 5.1.11 表达谱m RNA测序及数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 VitC和 JAK2 抑制剂处理下F9 细胞表达谱m RNA测序分析 |
| 5.2.2 VitC在 JAK2 活性抑制的条件下促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.3 激活JAK2 不利于VitC促进F9 细胞的多能性 |
| 5.2.4 VitC诱导多能性相关基因Nanog、Esrrb、Prdm14和Prdm16 的表达且依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.5 VitC诱导神经成熟相关基因的表达且严格依赖JAK2 的激活 |
| 5.2.6 VitC激活的JAK2 分别通过依赖 STAT2 和不依赖 STAT2 的途径诱导多能性相关基因和分化相关基因的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 研究有待改进之处 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）葡萄胚珠特异表达转录因子VvNAC26的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 葡萄无核形状的研究概况 |
| 1.2.1 葡萄无核性状的形成机理 |
| 1.2.2 葡萄无核性状的研究方向 |
| 1.3 NAC转录因子家族研究进展 |
| 1.3.1 NAC转录因子家族的结构与分类 |
| 1.3.2 NAC转录因子家族的生物学功能 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 葡萄胚珠特异表达转录因子VvNAC26基因及其启动子的克隆与表达分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 菌株及质粒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 葡萄不同发育时期的胚珠样品采集 |
| 2.2.2 RNA提取与反转录 |
| 2.2.3 VvNAC26在葡萄不同器官与胚珠不同发育时期的表达分析 |
| 2.2.4 VvNAC26基因的克隆及其亚细胞定位分析 |
| 2.2.5 VvNAC26基因保守结构域与进化树分析 |
| 2.2.6 VvNAC26基因启动子的克隆及其序列分析 |
| 2.2.7 VvNC26基因启动子缺失分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 VvNAC26在葡萄不同器官与胚珠不同发育时期的表达分析 |
| 2.3.2 VvNAC26基因的克隆及其亚细胞定位分析 |
| 2.3.3 VvNAC26基因保守结构域与进化树分析 |
| 2.3.4 VvNAC26基因启动子的克隆及其序列分析 |
| 2.3.5 VvNAC26基因启动子缺失分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 葡萄胚珠特异表达转录因子VvNAC26的功能研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 菌株及质粒 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 VvNAC26基因过表达载体的构建 |
| 3.2.2 VvNAC26基因转化Micro-Tom |
| 3.2.3 VvNAC26基因过表达株系的鉴定 |
| 3.2.4 VvNAC26基因过表达番茄株系果实与种子数据分析 |
| 3.2.5 转基因株系中部分基因的表达分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 VvNAC26过表达载体转化Micro-Tom及株系鉴定 |
| 3.3.2 转基因植株表型分析 |
| 3.3.3 转基因株系中部分基因的表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 葡萄胚珠特异表达转录因子VvNAC26转录活性分析与互作蛋白筛选 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 菌株及质粒 |
| 4.1.5 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 pGBKT7-VvNAC26诱饵载体的构建 |
| 4.2.2 诱饵蛋白的转录活性分析与毒性检测 |
| 4.2.3 共转化酵母感受态细胞与阳性克隆的鉴定 |
| 4.2.4 候选基因点对点回复验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 诱饵蛋白的转录激活作用检测与毒性试验 |
| 4.3.2 VvNAC26互作蛋白的筛选 |
| 4.3.3 候选基因点对点回复验证 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）拟南芥D1蛋白成熟过程的生理意义研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 光合作用概述 |
| 1.2 PSⅡ是光合电子传递链中重要的蛋白复合体 |
| 1.3 PSⅡ复合体实现光能捕获到水分子裂解的结构基础 |
| 1.4 PSⅡ复合体的维持及演化 |
| 1.4.1 PSⅡ超级复合体的从头生物合成及光损伤修复 |
| 1.4.2 维持PSⅡ超级复合体各亚基计量数稳定的CORR假说 |
| 1.4.3 PSⅡ反应中心演化过程 |
| 1.5 D1 蛋白概述 |
| 1.6 CTP研究概述 |
| 1.7 本课题研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及培养条件 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 抗生素 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产氧光合生物Ctp蛋白检索、序列比对及系统发育树构建 |
| 2.2.2 拟南芥种子消毒灭菌 |
| 2.2.3 拟南芥T-DNA插入突变体鉴定 |
| 2.2.4 拟南芥CRISPR/Cas9 系统构建atctpb-1 突变体及鉴定方法 |
| 2.2.5 植物RNA提取、反转录和实时定量PCR |
| 2.2.6 SDS-PAGE、SDS-urea-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹分析 |
| 2.2.7 抗体制备及纯化 |
| 2.2.8 叶绿体提取 |
| 2.2.9 叶绿体亚细胞器定位分析 |
| 2.2.10 BN-PAGE 蛋白电泳/SDS-PAGE 蛋白电泳 |
| 2.2.11 载体构建 |
| 2.2.12 DH5α、BL-21和GV3101 感受态细胞制备与转化 |
| 2.2.13 体外Ctp蛋白提取及酶活性实验 |
| 2.2.14 植物转基因实验 |
| 2.2.15 植物荧光参数测量 |
| 2.2.16 Ctp蛋白三维结构分析 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 CtpA从 CtpB和 CtpC分化而来并在产氧光合生物中演化出剪切pD1 的功能 |
| 3.1.1 CtpA、CtpB和 CtpC在产氧光合生物演化的早期就发生了分化 |
| 3.1.2 拟南芥CtpB和 CtpC蛋白的缺失不会改变植物的生长和 D1 蛋白的成熟 |
| 3.1.3 其它光合模式生物的CtpA蛋白可以剪切拟南芥pD1 蛋白 |
| 3.1.4 AtCtpA在剪切拟南芥和蓝藻pD1 蛋白时表现最强的酶切活性 |
| 3.1.5 突变体atctpa中35S启动子驱动的AtCtpB和 AtCtpC表型分析 |
| 3.1.6 AtCtpB和 AtCtpC蛋白体外活性测试中不能剪切pD1 蛋白的碳末端 |
| 3.1.7 产氧光合生物的CtpB和 CtpC蛋白酶都没有剪切pD1 蛋白的活性 |
| 3.2 D1 蛋白成熟的结果而非过程对PSⅡ的功能是必须的 |
| 3.2.1 两种替代D1 成熟的方案 |
| 3.2.2 核编码的成熟D1 蛋白可以进入叶绿体恢复atctpa突变体表型 |
| 3.2.3 外源成熟D1 可以正常组装PSⅡ复合体 |
| 3.2.4 外源成熟D1 蛋白构成的PSⅡ复合体显示正常的光合活性 |
| 3.2.5 外源成熟的D1 蛋白可以修复光损伤的PSⅡ复合体 |
| 3.2.6 叶绿体基质中成熟的D1 蛋白同样可以恢复atctpa突变体的表型 |
| 3.2.7 叶绿体基质成熟的D1 蛋白同样可以用于组装PSⅡ超级复合体 |
| 3.2.8 叶绿体基质成熟D1 蛋白构成的PSⅡ复合体与野生型显示一样的活性 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 AtCtpA是拟南芥D1 蛋白成熟的唯一功能酶 |
| 4.2 产氧光合生物中CtpA蛋白酶的共同祖先在演化过程中获得了剪切pD1 的活性 |
| 4.3 CtpA与 pD1 底物的关系 |
| 4.4 D1 蛋白的碳末端延伸对于产氧光合生物可能是不必要的 |
| 4.5 D1 蛋白叶绿体内合成和碳末端肽酶类囊体腔内剪切对光合生物更有利 |
| 4.6 核编码的D1 蛋白可以完全互补叶绿体pD1 蛋白成熟的缺陷表型 |
| 4.7 基于D1 蛋白和CtpA蛋白酶的产氧光合作用演化观点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）蓖麻抗旱性及类受体蛋白激酶功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 蓖麻 |
| 1.1.1 蓖麻简介及应用 |
| 1.2 植物响应干旱胁迫的机制 |
| 1.2.1 植物响应干旱胁迫的生理机制 |
| 1.2.2 植物响应干旱胁迫的分子机制 |
| 1.3 植物类受体蛋白激酶的研究概况 |
| 1.4 植物响应干旱胁迫的多组学研究进展 |
| 1.5 目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 干旱胁迫下蓖麻的表型及生理变化 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 培养条件 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 培养基的配置方法 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 干旱处理方法 |
| 2.2.2 光合作用和呼吸速率测定 |
| 2.2.3 H_2O_2和丙二醛(MDA)测定 |
| 2.2.4 抗氧化酶活性测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 干旱胁迫下蓖麻的表型变化及抗性品系筛选 |
| 2.3.2 PEG-6000胁迫下蓖麻生理指标测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 PEG-6000胁迫下蓖麻根系转录组学和蛋白质组学分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 生物信息相关数据库和软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 PEG-6000处理蓖麻植株方法 |
| 3.2.2 蓖麻根系转录组学研究方法 |
| 3.2.3 蓖麻根系蛋白质组学研究方法 |
| 3.2.4 蓖麻根系转录组学和蛋白质组学关联分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 蓖麻根系转录组学分析 |
| 3.3.2 蓖麻根系蛋白质组学分析 |
| 3.3.3 蓖麻根系转录组学和蛋白质组学关联分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 干旱胁迫下蓖麻类受体蛋白激酶功能研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 植物培养 |
| 4.1.3 菌株和载体 |
| 4.1.4 试验试剂 |
| 4.1.5 培养基配置方法 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 组学数据验证 |
| 4.2.2 类受体蛋白激酶生物信息学分析 |
| 4.2.3 蓖麻根系总RNA提取 |
| 4.2.4 mRNA反转录合成cDNA |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析 |
| 4.2.6 类受体蛋白激酶基因亚细胞定位分析 |
| 4.2.7 类受体蛋白激酶基因遗传转化拟南芥 |
| 4.2.8 转基因拟南芥抗旱性分析 |
| 4.2.9 类受体蛋白激酶基因遗传转化蓖麻 |
| 4.2.10 蛋白质相互作用分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 组学数据验证 |
| 4.3.2 类受体蛋白激酶生物信息学分析 |
| 4.3.3 类受体蛋白激酶亚细胞定位 |
| 4.3.4 拟南芥的遗传转化 |
| 4.3.5 转基因拟南芥植株的抗旱性分析 |
| 4.3.6 SPKBSK7基因表达模式分析 |
| 4.3.7 SPKBSK7基因遗传转化蓖麻植株 |
| 4.3.8 蛋白质相互作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（9）脐橙果皮色泽变异及番茄红素β-环化酶的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 课题的提出 |
| 2 前人研究进展 |
| 2.1 芽变的研究进展 |
| 2.1.1 芽变的产生 |
| 2.1.2 芽变机理的研究 |
| 2.1.3 芽变的价值 |
| 2.2 植物扇形嵌合体的研究进展 |
| 2.3 植物叶绿素降解的研究进展 |
| 2.3.1 叶绿素降解的研究概况 |
| 2.3.2 植物叶绿素降解途径 |
| 2.3.3 叶片和果实叶绿素降解的差异 |
| 2.3.4 滞绿基因STAY-GREEN(SGR)研究进展 |
| 2.3.5 植物滞绿突变体 |
| 2.4 植物类胡萝卜素代谢的研究进展 |
| 2.4.1 类胡萝卜素简介 |
| 2.4.2 植物类胡萝卜素代谢途径 |
| 2.4.3 植物类胡萝卜素代谢的转录调控 |
| 2.4.4类胡萝卜素代谢与番茄红素β-环化酶2 |
| 2.5 柑橘果实成熟过程中叶绿素降解和类胡萝卜素合成的研究进展 |
| 2.5.1 柑橘果实叶绿素降解及其调控 |
| 2.5.2 柑橘果实类胡萝卜素代谢及其调控 |
| 2.5.3 柑橘果实色泽突变体 |
| 3 研究目的与内容 |
| 第二章 :脐橙果皮棕色变异‘宗橙’的表型及其突变机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株、质粒和载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 果实常规生理指标测定 |
| 2.2.1.1 果实横径、纵径、果皮厚度测量和果重称量 |
| 2.2.1.2 果实色差测定 |
| 2.2.1.3 果实硬度测定 |
| 2.2.1.4 可溶性固形物和可滴定酸含量测定 |
| 2.2.1.5 维生素C含量测定 |
| 2.2.2 叶绿素提取及测定 |
| 2.2.3 类胡萝卜素提取及测定 |
| 2.2.4 激素提取及测定 |
| 2.2.5 初生代谢物提取及测定 |
| 2.2.6 挥发性代谢物提取及测定 |
| 2.2.7 淀粉含量测定及分析 |
| 2.2.8 显微镜及电镜观察 |
| 2.2.8.1 体式显微镜观察 |
| 2.2.8.2 倒置显微镜观察 |
| 2.2.8.3 透射电镜观察 |
| 2.2.9 果实的前期处理、贮藏和取样 |
| 2.2.10 呼吸速率测定 |
| 2.2.11 失重率测定 |
| 2.2.12 腐烂率测定 |
| 2.2.13 异味物质测定 |
| 2.2.14 青霉菌接种及取样 |
| 2.2.15 倍性鉴定 |
| 2.2.16 转录组分析 |
| 2.2.17 加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
| 2.2.18 DNA提取与基因组重测序分析 |
| 2.2.19 RNA提取与c DNA合成 |
| 2.2.20 基因克隆、序列分析、系统树构建及3D结构预测分析 |
| 2.2.21 实时荧光定量PCR分析 |
| 2.2.22 总蛋白提取和Western blot分析 |
| 2.2.23 亚细胞定位 |
| 2.2.24 烟草瞬时表达 |
| 2.2.25 柑橘叶片黑暗处理 |
| 2.2.26 光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(Fv/Fm)测定 |
| 2.2.27 类胡萝卜素工程菌实验 |
| 2.2.28 农杆菌介导的柑橘愈伤组织遗传转化 |
| 2.2.29 酵母双杂(Y2H) |
| 2.2.30 双分子荧光互补实验(BiFC) |
| 2.2.31 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ‘宗橙’的来源 |
| 3.2‘宗橙’的农艺性状与果实常规生理指标 |
| 3.3 ‘宗橙’果实有色层显微结构特征 |
| 3.4 ‘宗橙’果实有色层叶绿素含量变化 |
| 3.5 ‘宗橙’果实有色层类胡萝卜素含量变化 |
| 3.6 ‘宗橙’果实有色层激素含量变化 |
| 3.7 ‘宗橙’果实有色层初生代谢物变化 |
| 3.8 ‘宗橙’果实有色层挥发性代谢物变化 |
| 3.9 ‘宗橙’有色层淀粉颗粒和淀粉含量变化 |
| 3.10 贮藏期‘宗橙’果实常规品质变化 |
| 3.10.1 果实表型变化 |
| 3.10.2 果实色差值变化 |
| 3.10.3 果实可溶性固形物和可滴定酸的含量变化 |
| 3.10.4 果实硬度变化 |
| 3.10.5 果实出汁率变化 |
| 3.11 贮藏期‘宗橙’果实失重率变化 |
| 3.12 贮藏期‘宗橙’果实腐烂率变化 |
| 3.13 贮藏期‘宗橙’果实呼吸强度变化 |
| 3.14 贮藏期‘宗橙’果实异味物质变化 |
| 3.15 贮藏期‘宗橙’果实激素含量变化 |
| 3.16 贮藏期‘宗橙’果实初生代谢物含量变化 |
| 3.17 贮藏期‘宗橙’果实挥发性代谢物含量变化 |
| 3.18 ‘宗橙’果实对青霉菌的抗性 |
| 3.19 ‘宗橙’倍性鉴定 |
| 3.20 ‘宗橙’突变基因鉴定 |
| 3.20.1 ‘宗橙’和‘伦晚脐橙’的比较转录组分析 |
| 3.20.2 ‘宗橙’扇形嵌合体不同部位的比较转录组分析 |
| 3.20.3 ‘宗橙’和伦晚的基因组重测序比较分析 |
| 3.20.4 ‘宗橙’突变基因鉴定 |
| 3.20.5 ‘宗橙’中SGR基因表达分析 |
| 3.20.6 ‘宗橙’中SGR基因的克隆和测序分析 |
| 3.20.7 ‘宗橙’中SGR蛋白序列及蛋白表达分析 |
| 3.21 柑橘SGR基因及其同源基因SGRL的系统树分析 |
| 3.22 柑橘SGR基因的表达分析 |
| 3.23 SGR基因的亚细胞定位 |
| 3.24 SGR基因促进叶绿素降解 |
| 3.24.1 SGR基因瞬时表达烟草叶片 |
| 3.24.2 ‘宗橙’和‘伦晚脐橙’枯叶的表型对比 |
| 3.24.3 ‘宗橙’和‘伦晚脐橙’叶片的黑暗处理比较 |
| 3.25 SGR基因抑制类胡萝卜素合成 |
| 3.25.1 SGR等位基因超表达类胡萝卜素工程菌分析 |
| 3.25.2 SGR等位基因超表达柑橘愈伤组织分析 |
| 3.26 SGR与 PSY蛋白互作分析 |
| 3.27 ‘宗橙’SGR突变的多效性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ‘宗橙’的突变机理 |
| 4.2 柑橘 SGR 等位基因的功能分化 |
| 4.3 柑果中叶绿素和类胡萝卜素代谢调控 |
| 4.4 ‘宗橙’的价值及开发利用 |
| 4.5 ‘宗橙’和‘伦晚脐橙’在采后贮藏特性和抗性上差异产生的可能机制 |
| 第三章 :甜橙CsLCYb2 及其互作转录因子在果实色泽形成中的功能 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株、质粒和载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 系统树构建、蛋白序列及3D结构分析 |
| 2.2.2 DNA提取、RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.3 基因克隆,序列分析及系统树构建 |
| 2.2.4 实时定量PCR |
| 2.2.5 农杆菌介导的番茄遗传转化 |
| 2.2.6 类胡萝卜素提取及测定 |
| 2.2.7 透射电镜观察 |
| 2.2.8 激素提取及测定 |
| 2.2.9 初生代谢物提取及测定 |
| 2.2.10 酵母单杂(Y1H) |
| 2.2.11 烟草瞬时表达及双荧光素酶检测 |
| 2.2.12 凝胶阻滞实验(EMSA) |
| 2.2.13 蛋白提取和Western blot分析 |
| 2.2.14 亚细胞定位 |
| 2.2.15 转录活性分析 |
| 2.2.16 农杆菌介导的柑橘愈伤组织遗传转化 |
| 2.2.17 总叶绿素提取及测定 |
| 2.2.18 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CsLCYb2 等位基因的系统树、蛋白序列及3D结构分析 |
| 3.2 番茄CsLCYb2 等位基因超表达系的获得和表型分析 |
| 3.3 番茄CsLCYb2 等位基因超表达系果实类胡萝卜素含量及基因表达分析 |
| 3.4 番茄CsLCYb2 等位基因超表达系叶片类胡萝卜素含量及基因表达分析 |
| 3.5 番茄CsLCYb2 等位基因超表达系果实质体超微结构观察 |
| 3.6 番茄CsLCYb2 等位基因超表达系番茄果实激素含量分析 |
| 3.7 番茄CsLCYb2 等位基因超表达系果实初生代谢物分析 |
| 3.8 柑橘CsLCYb2a启动子单杂筛库结果与分析 |
| 3.8.1 诱饵酵母菌株的AbA最佳使用浓度 |
| 3.8.2 酵母单杂筛库 |
| 3.8.3 阳性克隆的序列分析 |
| 3.9 转录因子CsMADS3 的功能研究 |
| 3.9.1 CsMADS3 蛋白与CsLCYb2 启动子互作验证 |
| 3.9.1.1 Y1H验证 |
| 3.9.1.2 双荧光素酶验证 |
| 3.9.1.3 EMSA验证 |
| 3.9.2 CsMADS3 基因序列和蛋白特性分析 |
| 3.9.3 CsMADS3 基因表达分析 |
| 3.9.4 CsMADS3 蛋白转录活性分析 |
| 3.9.5 CsMADS3 蛋白亚细胞定位 |
| 3.9.6 CsMADS3 超表达柑橘愈伤的功能分析 |
| 3.9.6.1 柑橘愈伤CsMADS3 超表达系的获得和表型分析 |
| 3.9.6.2 柑橘愈伤CsMADS3 超表达系内质体超微结构观察 |
| 3.9.6.3 柑橘愈伤CsMADS3 超表达系类胡萝卜素含量分析 |
| 3.9.6.4 柑橘愈伤CsMADS3 超表达系类胡萝卜素基因表达分析 |
| 3.9.6.5 柑橘愈伤CsMADS3 超表达系类激素含量分析 |
| 3.9.7 CsMADS3 超表达番茄的功能分析 |
| 3.9.7.1 番茄CsMADS3 超表达系的获得和表型分析 |
| 3.9.7.2 番茄CsMADS3 超表达系果实类胡萝卜素含量分析 |
| 3.9.7.3 番茄CsMADS3 超表达系果实类胡萝卜素基因表达分析 |
| 3.9.7.4 番茄CsMADS3 超表达系果实有色体超微结构观察 |
| 3.9.7.5 番茄CsMADS3 超表达系果实激素含量分析 |
| 3.9.7.6 番茄CsMADS3 超表达系果实叶绿素含量及叶绿素降解相关基因表达分析 |
| 3.9.8 CsMADS3 蛋白与类胡萝卜代谢和叶绿素降解途径基因启动子互作验证 |
| 3.9.8.1 EMSA验证 |
| 3.9.8.2 双荧光素酶验证 |
| 3.10 转录因子CsERF061的功能研究 |
| 3.10.1 CsERF061 蛋白与CsLCYb2 启动子互作验证 |
| 3.10.1.1 Y1H验证 |
| 3.10.1.2 EMSA验证 |
| 3.10.1.3 双荧光素酶验证 |
| 3.10.2 CsERF061基因序列和蛋白特性分析 |
| 3.10.3 CsERF061基因表达分析及乙烯响应 |
| 3.10.4 CsERF061蛋白亚细胞定位 |
| 3.10.5 CsERF061蛋白转录活性分析 |
| 3.10.6 CsERF061超表达柑橘愈伤的功能分析 |
| 3.10.6.1 柑橘愈伤CsERF061超表达系的获得和表型分析 |
| 3.10.6.2 柑橘愈伤CsERF061超表达系内质体超微结构观察 |
| 3.10.6.3 柑橘愈伤CsERF061超表达系类胡萝卜素含量分析 |
| 3.10.6.4 柑橘愈伤CsERF061超表达系类胡萝卜素基因表达分析 |
| 3.10.6.5 柑橘愈伤CsERF061超表达系激素含量分析 |
| 3.10.7 CsERF061超表达番茄的功能分析 |
| 3.10.7.1 番茄CsERF061超表达系的获得和表型分析 |
| 3.10.7.2 番茄CsERF061超表达系类胡萝卜素含量分析 |
| 3.10.7.3 番茄CsERF061超表达系类胡萝卜素基因表达分析 |
| 3.10.7.4 番茄CsERF061超表达系果实有色体超微结构观察 |
| 3.10.7.5 番茄CsERF061超表达系类激素含量分析 |
| 3.10.8 CsERF061蛋白与其它类胡萝卜代谢代谢途径基因启动子互作验证 |
| 3.10.8.1 EMSA验证 |
| 3.10.8.2 双荧光素酶验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柑橘CsLCYb2 等位基因的功能差异 |
| 4.2 柑橘CsLCYb2 等位基因超表达对番茄果实代谢流的影响 |
| 4.3 柑橘CsLCYb2 等位基因丰富了合成生物学工具箱 |
| 4.4 CsMADS3 直接调控叶绿素降解和类胡萝卜代谢 |
| 4.5 CsERF061响应乙烯并直接调控类胡萝卜代谢 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 I 部分实验图表 |
| 附录 Ⅱ 攻读博士期间的科研成果 |
| 致谢 |
（10）抗CRISPR-Cas蛋白的生物信息学分析与识别研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物信息学概览 |
| 1.1.1 生物信息学产生的背景 |
| 1.1.2 生物信息学的研究内容 |
| 1.2 原核生物基因组 |
| 1.3 原核生物基因组中的重复序列 |
| 1.4 CRISPR-Cas系统 |
| 1.4.1 CRISPR的发现 |
| 1.4.2 CRISPR的构成和特点 |
| 1.4.3 Cas蛋白 |
| 1.4.4 CRISPR-Cas系统的功能和免疫过程 |
| 1.4.5 CRISPR-Cas系统的分类 |
| 1.5 Acrs蛋白 |
| 1.5.1 Acrs的发现 |
| 1.5.2 Acrs的抑制机制 |
| 1.5.3 Acrs蛋白的应用 |
| 1.6 细菌和噬菌体之间的竞争 |
| 1.7 Acrs相关的生物信息学研究 |
| 1.8 本文主要工作 |
| 1.9 本文主要创新点 |
| 1.10 论文的结构 |
| 第二章 Anti-CRISPRdb:Acrs蛋白的综合在线资源库 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 数据库的构建 |
| 2.2.1 数据的来源 |
| 2.2.2 Acrs家族内部之间的序列相似性 |
| 2.2.3 Acrs与 VFDB数据库的序列相似性信息 |
| 2.2.4 非冗余数据集构建 |
| 2.2.5 数据库的构建 |
| 2.3 Anti-CRISPRdb数据库的使用 |
| 2.4 数据库进一步更新 |
| 2.4.1 进一步更新的背景 |
| 2.4.2 更新库中数据的收集 |
| 2.4.3 更新版本库和老版本库数据比较 |
| 2.4.4 新版本数据库允许用户查看Acrs的邻居基因 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 Acrs的生物信息学分析和预测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 数据集的构建 |
| 3.2.2 基因组岛、前噬菌体片段以及两者的生物信息学识别 |
| 3.2.3 HTH功能域注释 |
| 3.2.4 决策树和随机森林 |
| 3.2.5 Acrs特征提取 |
| 3.2.6 评价指标和评价方法 |
| 3.2.7 交叉验证过程中样本的划分方式 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 Acrs特征 |
| 3.3.2 最优参数确定和不同随机状态下的交叉验证 |
| 3.3.3 跨物种交叉验证 |
| 3.3.4 应用该算法预测新近识别Acrs的物种 |
| 3.3.5 Acr Detector识别结果的特点 |
| 3.3.6 基于该算法建立网络服务和本地执行工具 |
| 3.3.7 Acr Detector的优点和缺点 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 Cas蛋白、cas基因座和类型注释 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 Cas蛋白家族的收集和构建 |
| 4.2.2 马尔可夫图聚类 |
| 4.2.3 识别Cas蛋白、cas基因座和基因座类型的基本流程 |
| 4.2.4 提交基因组序列时的注释 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Cas Locus Anno的使用 |
| 4.3.2 对于Cas Locus Anno的识别速度评价 |
| 4.3.3 对于Cas Locus Anno的识别准确性进行评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 工作总结与展望 |
| 5.1 本文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 5.2.1 Anti-CRISPRdb的后续工作 |
| 5.2.2 Acr Detector的后续工作 |
| 5.2.3 Cas Locus Anno的后续工作 |
| 5.2.4 基于Acr Detector和 Cas Locus Anno的后续工作 |
| 5.2.5 现有工作可扩展的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
四、利用NCBI相关资源电子定位基因的方法和实践（论文参考文献）
- [1]基于NCBI数据库的高中生物学课程资源开发与利用[D]. 谢海婷. 广西师范大学, 2021(09)
- [2]水稻抗白叶枯病基因x349的精细定位和两个类病斑早衰突变体基因的图位克隆[D]. 郑宇涵. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]山桐子油脂合成相关基因的克隆及功能分析[D]. 范睿深. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]哈氏噬纤维菌LPS合成相关基因chu2177、chu2178、chu1927、chu2532和chu3392的功能研究[D]. 谭亚红. 山东大学, 2021(12)
- [5]维生素C转运蛋白SVCT2受体功能的发现及其介导的JAK2信号传递途径的研究[D]. 韩卓. 西北农林科技大学, 2021
- [6]葡萄胚珠特异表达转录因子VvNAC26的功能研究[D]. 董如壮. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [7]拟南芥D1蛋白成熟过程的生理意义研究[D]. 常伟东. 西北大学, 2021(12)
- [8]蓖麻抗旱性及类受体蛋白激酶功能研究[D]. 赵永. 东北林业大学, 2021(09)
- [9]脐橙果皮色泽变异及番茄红素β-环化酶的调控研究[D]. 朱凯杰. 华中农业大学, 2020
- [10]抗CRISPR-Cas蛋白的生物信息学分析与识别研究[D]. 董川. 电子科技大学, 2020(03)